Нокаутних миша - генетично змінена миша, у якій експресія одного або декількох генів вимкнена за допомогою нокауту генів. Нокаутні миші є важливими моделями для дослідження генів тварин, які були секвенирован, але функція яких невідома. Інактівіруя специфічний ген у миші і досліджуючи зміни її фенотипу (поведінки, зовнішнього вигляду), дослідники часто можуть зробити висновки про функції даного гена.
Миші є найближчим до людини модельним організмом, до якого може застосовуватися подібна методика дослідження, навіть для щурів її застосування набагато складніше. Тому миші широко використовуються в дослідженнях, що стосуються фізіології людини.
Використання
Вимкнення гена допомагає дослідникам отримувати інформацію про його функцію. Оскільки багато генів для мишей і людини є загальними, дослідження їх функції в мишах дозволяє отримувати дані про те, за що цей (або подібний ген) відповідає в людському організмі. Зокрема, це дуже важливо при ідентифікації генів, які відповідають за захворювання людини. Прикладами досліджень, в яких можуть використовуватися нокаутні миші, є вивчення та моделювання різних типів раку, ожиріння, хвороб серця, діабету, артритів, старіння і хвороби Паркінсона. За допомогою нокаутних мишей можна досліджувати ліки і різні види терапії. Щорічно в різних експериментах використовують мільйони нокаутних мишей.
Існує кілька тисяч ліній нокаутних мишей. Багато мишачих моделей названий по імені гена, який інактивується. Наприклад, p53 нокаутні миші названі по гену р53, що кодує білок, однією з найважливіших функцій якого є пригнічення росту пухлин за рахунок припинення поділу клітин. Люди, народжені з мутаціями гена p53, які страждають від синдрому Лі-Фраумені, при цьому катастрофічно зростає ймовірність розвитку раку кісток, крові і грудей в ранньому віці.
Є деякі варіації в процедурах отримання нокаутних мишей, але нижче розписана загальна спрощена схема.
- Ген, який хочуть нокаутувати, ізолюють з мишачою генної бібліотеки. Потім послідовність ДНК змінюють таким чином, щоб зробити ген неробочим. Зазвичай в новій послідовності повинен бути також маркерний ген, якого немає в нормальних мишей, і відповідає за резистентність до якого антибіотика, токсичного агента, або забезпечує якусь візуальну зміну (кольору, флюоресценції).
- Ембріональні клітини ізолюють з мишачою бластоцисти і вирощують in vitro. В даному прикладі клітини бластоцисти беруть з білої миші.
- Нову послідовність з 1 кроку переносять в клітини бластоцисти шляхом електропорації. За допомогою природної гомологичной рекомбінації в деяких ембріональних клітинах відбудеться вставка нової послідовності з нокаутованим геном на місце нормального гена. Шанси на вдалу рекомбінації відносно низькі, тому більшість клітин мати нову послідовність тільки в одній з двох хромосом - вони будуть гетерозиготними.
- Ембріональні клітини, які несуть нокаутних ген, ізолюють за допомогою маркерного гена (см крок 1). Наприклад, клітини без вставки не виживуть при дії якого токсичного агента, до якого резистентні нокаутні з досліджуваних геном клітини.
- Нокаутні стовбурові клітини з кроку 4 імплантують в мишачі бластоцисти (в цьому випадку з сірої миші). Тепер бластоцисти містять два типи стовбурових клітин: дикого типу (з сірої миші) і нокаутні клітини (з білої миші). Ці бластоцисти потім імплантують в матку названої матері. Деякі частини в тілі новонароджених мишей відбуватимуться з клітин дикого типу, а деякі з нокаутних клітин, такі миші називаються химерними і мають сіро-біле забарвлення. Якщо схрестити химерних мишей між собою, частина потомства буде білого кольору і вони будуть гомозиготними по нокаутних геном.
обмеження
Хоча нокаут генів в мишах надзвичайно потужним засобом для досліджень, є значні обмеження в його використанні. Близько 15 відсотків нокауту генів є летальними під час ембріонального розвитку. Цієї проблеми можна уникнути, отримуючи умовно нокаутних мишей.
При нокауті генів мишей іноді важко отримати чітко відрізняється від дикого типу фенотип. Іноді також виникають проблеми з порівнянням інактивації гена в організмі людини і миші. Наприклад, мутація гена p53, яка у половині видів раку людини і призводить до розвитку пухлин в певних тканинах. У мишей, нокаутних по p53, рак розвивається в зовсім іншому наборі тканин, ніж при вищезазначених мутаціях у людини.
