Експертний висновок - доктор медичних наук, професор кафедри патологічної анатомії лікувального факультету РГМУ М.В. Самойлов
Навчальний посібник виконано в рамках інноваційної освітньої програми Російського університету дружби народів, напрямок "Комплекс експортоорієнтованих інноваційних освітніх програм з пріоритетних напрямів науки і технологій"
Тема № 8. Білкові молекули, що характеризують клітинну адгезію Тема № 9. Імуногістохімія ангіогенезу
ПРИКЛАДНІ ПИТАННЯ Імуногістохімія
Тема № 8. Білкові молекули, що характеризують клітинну адгезію
При формуванні тканини і в ході її функціонування важливу роль відіграють процеси міжклітинних комунікацій - впізнавання і адгезія. Впізнавання - це специфічна взаємодія клітини з іншого клітиною або позаклітинним матриксом; в результаті впізнавання неминуче розвивається ряд процесів, одним з яких є адгезія. Адгезія - необхідна умова підтримки тканинної структури. Адгезію називають здатність клітин вибірково прикріплюватися один до одного або до компонентів позаклітинного матриксу за допомогою спеціальних глікопротеїнів - молекул адгезії. Прикріплення клітин до компонентів позаклітинного матриксу здійснюють точкові (фокальні) адгезійні контакти, а прикріплення клітин один до одного - міжклітинні контакти.
Молекули клітинної адгезії можуть сприяти інвазії пухлини і метастазування. Пусковим механізмом прогресування пухлини може стати зміна міжклітинних зв'язків в її тканини, яке також грає важливу роль на різних етапах метастатичного каскаду.
Інвазія пухлини протікає в три фази і пов'язана з генетичними перебудовами, які полягають в дефектах генів, що кодують глікопротеїни клітинної адгезії. Клітини здатні до переміщення тільки після дезінтеграції адгезійних контактів. Подібні процеси відбуваються при виселенні злоякісних клітин з пухлини і їх метастазуванні, коли окремі трансформовані клітини відокремлюються від пухлини, мігрують і утворюють нові пухлинні вогнища (метастази). Наприклад, метастази і розростання карцином шлунка, ендометрія, яєчника виникають внаслідок порушення адгезії пухлинних клітин, що містять ген Е-кадгерінов, і експресії його дефектного продукту.
Перша фаза інвазії пухлини характеризується послабленням контактів між клітинами, про що свідчать зменшення кількості міжклітинних контактів, зниження концентрації деяких адгезивних молекул і, навпаки, посилення експресії інших, що забезпечують мобільність пухлинних клітин і їх контакт з екстрацелюлярний матриксом. На клітинної поверхні знижується концентрація іонів кальцію, що призводить до підвищення негативного заряду пухлинних клітин. Посилюється експресія рецепторів, що забезпечують прикріплення клітини до компонентів екстрацелюлярного матриксу - ламінін, фібронектину, колагеном. У другій фазі пухлинна клітина секретирует протеолітичні ферменти і їх активатори, які забезпечують деградацію екстрацелюлярного матриксу, звільняючи тим самим їй шлях для інвазії. У той же час продукти деградації фібронектину і ламініну є хемоаттрактантамі для пухлинних клітин, які мігрують в зону деградації в ході третьої фази інвазії, а потім процес повторюється знову.
Особливості експресії і розподілу молекул клітинної адгезії в тканини пухлини можуть служити додатковими критеріями злоякісності при оцінці прогнозу захворювання. Зокрема, розглядаються нижче Е-кадгерінов, Катеніну, СD44, матриксних металлопротеінази - виступають в якості маркерів інвазії і метастазування.
Міцність адгезивних зв'язків клітин забезпечують Е-кадгерінов, що відноситься до сімейства кадгерінов, і протеогликан CD44.
Кадгерінов - трансмембранні глікопротеїни, які мають амінотермінального екстрацелюлярний частина, трансмембранний компонент і внутрішньоклітинний домен, що локалізується в цитоплазмі клітин, - є важливими елементами міжклітинних зв'язків і в системі передачі сигналів, які здійснюють контроль міграції, зростання і диференціювання клітин.
Е-кадгерінов - представник сімейства класичних кадгерінов, кальцій-залежна адгезивная молекула, характерна для клітин епітеліальних тканин. Довгі екстрацелюлярний ділянки молекули Е-кадгерінов формують на поверхні клітин паралельні димери, які при контакті з іншими молекулами Е-кадгерінов сусідніх епітеліальних клітин утворюють міцні зв'язки за типом блискавки ( "zippers"). Цитоплазматичний домен Е-кадгерінов взаємодіє з цитоплазматичними протеїнами: бета-Катенін і гамма-Катенін. Ці молекули реагують з альфа-Катенін, який, в свою чергу, пов'язує кадгерінов-катеніновий комплекс з Актинові цитоскелетом. Ця система забезпечує стабільні міжклітинні адгезивні зв'язку, а молекули Катеніну - регуляцію функції молекул Е-кадгерінов.
Порушення процесів регуляції функції молекул кадгерінов і Катеніну відбувається при мутації відповідних генів. Мутантні молекули Е-кадгерінов втрачають здатність зв'язуватися з Катеніну, а відповідно, і з актиновими волокнами, в результаті чого порушується стабільність міжклітинних контактів. Генетичні альтерації бета-Катенін порушують взаємодію між Е-кадгерінов і альфа-Катенін і також призводять до зниження міжклітинної адгезії.
Патологічні зміни Е-кадгерінов-пов'язаної міжклітинної адгезії ведуть до пухлинної прогресії і метастазування. Онкогенний ефект мутацій Е-кадгерінов пов'язаний з порушеннями морфогенетических властивостей клітини. Крім того, Е-кадгерінов, ймовірно, бере участь в регуляції активності протеїну клітинного циклу р53, в зв'язку з цим можна вважати що онкогенное дію мутацій Е-кадгерінов впливає на регуляцію клітинного циклу, апоптоз і контроль генетичної стабільності тканин.
В даний час відзначена позитивна кореляція між розподілом Е-кадгерінов і поганим прогнозом для різних пухлин. Невисока експресія Е-кадгерінов і Катеніну в епітеліальних новоутвореннях і меланома асоційована з низькою диференціюванням пухлини, локальної інвазією, залученням регіонарних лімфовузлів і меншою тривалістю життя.
Як правило, чим нижче диференціювання пухлини, тим менше експресія E-кадгерінов в тканини. Це характерно для карциноми сечового міхура, підшлункової залози, гепатоцелюлярного раку, в яких спостерігається відповідно зниження альфа-катенина і бета-Катенін. Імуногістохімічна реакція з антитілами до Е-кадгерінов в високодиференційований аденокарциноме товстого кишечника, як правило, демонструє фокальное фарбування пухлини, в помірно диференційовані - з полями неоднорідного слабкого фарбування структур, в низькодиференційований - пухлинні клітини Е-кадгерінов негативні.
CD44 - трансмембранний глікопротеїн, який бере участь в міжклітинних і клітинно-матриксних взаємодії і володіє властивостями рецептора гиалуроната. Існує всього 11 різновидів CD44 - стандартна, або так звана гемопоетичних изоформа (CD44H або CD44s), і 10 варіантних ізоформ (CD44v), які утворюються при альтернативному сплайсинг.
Молекули CD44 грають важливу роль в процесі розвитку пухлин і, як вважають, сприяють пухлинної прогресії. CD44 здатний стимулювати клітинну проліферацію, міграцію і зміна диференціювання клітин первинної пухлини. Експресія молекул CD44 значно посилюється в клітинах новоутворень. При взаємодії з гіалуронат-містять структурами, які входять до складу багатьох компонентів екстрацелюлярного матриксу: колагену, ламініну, хондроїтину сульфату, фібронектину і ін.
CD44 сприяє передачі міжклітинних сигналів, стимулює моторну і активність клітин. Володіючи протеазний дією, CD44 руйнує протеїни екстрацелюлярного матриксу, особливо багатого Гіалуронат, і сприяє інвазії пухлинних клітин, проникненню їх через базальну мембрану і судинні стінки в кровоносне русло.
Виражена експресія CD44 відзначається не тільки в епітелії пухлин, але і в клітинах строми - лімфоцитах, макрофагах і в компонентах екстрацелюлярного матриксу. Характерно, що експресія CD44 в стромі ніяк не пов'язана з його експресією в пухлинних клітинах. Однак є роботи, в яких відзначалася стимуляція імунної реакції пухлинними клітинами. Відомо, що CD44 також є маркером активації лімфоцитів. Стромальні елементи пухлини роблять значний вплив на регуляцію росту пухлини, а аномалії молекул CD44 сприяють розбудові компонентів екстрацелюлярного матриксу. Існують роботи, в яких виявлено кореляцію між прогнозом розвитку пухлини і Иммунореактивность клітин до CD44.
У багатьох пухлинах людини, таких як колоректальний рак, неходжкінська лімфома, рак молочної залози і меланома, білок CD44 може бути використаний як діагностичний і прогностичний маркер.
Значною мірою прогноз результату лікування онкологічних хворих залежить від оцінки ймовірності розвитку метастазів. До теперішнього часу дослідники не мають у своєму розпорядженні досить чіткими критеріями, що дозволяють розпізнати новоутворення з високим метастатичним потенціалом. Проте, ступінь інвазивного росту і метастазування пухлинних клітин може визначатися за їхньою здатністю розщеплювати компоненти екстраклеточной матриксу (ЕКМ) - базальні мембрани і міжтканинна строму, що складається з різних структурних білків: колагену, еластину, ламініну і т.д. Подолання базальної мембрани і просування по позаклітинного матриксу забезпечуються секрецією протеаз. Багато протеолітичні ферменти, такі як катепсини, серинові протеази, здатні лизировать окремі компоненти ЕКМ in vitro, однак розкладати все структури ЕКС можуть тільки матриксних металлопротеінази.
Матриксних металлопротеінази (ММП) - це сімейство ферментів, які здатні руйнувати позаклітинний матрикс або базальнумембрану. Вони грають важливу роль в зростанні пухлини та метастазуванні, так як забезпечують міграцію і впровадження пухлинних клітин. Активність цих ферментів регулюється тканинними інгібіторами і активаторами.
Свою назву матриксних металлопротеінази отримали за здатність специфічно гідролізувати основні білки екстраклеточной матриксу. ММП відносяться до сімейства цинкових металопротеїназ, так як містять в активному центрі Zn 2+. Відомо близько 20 представників цього сімейства.
Більшість ММП секретується клітинами у вигляді неактивних ферментів. У звичайних умовах в тканинах виявляються незначні кількості ММП, при цьому їх активація призводить до протеолитическому руйнування навколишніх клітку білків. Активацію більшості ММП здійснюють протеази типу плазміну і активатора плазміногену урокіназного типу. Деякі ММП можуть активізувати один одного. У нормі існує біологічний механізм обмеження протеолізу тканин, викликаного активними ММП, у вигляді секреції клітинами строми тканинних інгібіторів металопротеїназ (TIMP). В даний час добре вивчені три ТIМP з різних тканин людини - ТIМP-1, ТIМP-2, ТIМP-3. Це білки невеликого розміру, здатні формувати Нековалентні комплекси з багатьма членами сімейства матриксних металопротеїназ.
Злоякісні пухлини характеризуються інвазивним ростом і здатністю до метастазування. Деградація базальної мембрани і строми - пусковий фактор початку цих процесів. Багато пухлини мають локально збільшені рівні матриксних металопротеїназ, ферментів, здатних розкладати будь-який білок матриксу, що дозволяє багатьом дослідникам пов'язувати їх з інвазивним фенотипом пухлини. Свого часу пошук ферментів, здатних до розкладання базальних мембранних колагену, привів до ідентифікації ММП-2, відомої як коллагеназа IV типу.
У клінічних дослідженнях присутність великої кількості активної ММП-2 пов'язане з інвазивними раком молочної залози і карциномою легені. У хворих на рак гортані спостерігалася кореляція між експресією ММП-2 і наявністю метастазів в лімфатичних вузлах. Таким чином, продукція ММП-2 пухлинними клітинами може свідчити про їх инвазивном потенціал.
Останнім часом відбувається активний пошук прогностичних біохімічних маркерів, які могли б виявляти пацієнтів з високим ризиком виникнення рецидивів. На роль таких факторів прогнозу претендують багато пухлиноасоційованих протеази. Так, велика кількість робіт по раку молочної залози показало, що визначення змісту протеази активатора плазміногену урокіназного типу і його інгібіторів може мати величезне прогностичне значення в оцінці виникнення рецидивів. Крім того, високі рівні TIMP-2 в тканини раку молочної залози корелюють зі скороченням часу ремісії і повного виживання, а високий рівень ММП-11 пов'язаний з поганим прогнозом.
Матриксних металлопротеінази в даний час активно досліджуються як прогностичні фактори при багатьох інших локалізаціях пухлинного процесу. Показники експресії мРНК ММП-9 і TIMP-2 можуть передбачити виникнення рецидиву у хворих з поверхневою переходноклеточной карциномою сечового міхура. Інші дослідники рекомендують оцінювати рівні експресії ММП-2, TIMP-2 і ММП-14 (активатора ММП-2) для прогнозу виживаності при інвазивних ракових утвореннях сечового міхура.
Описано також рівні різновидів ММП при пухлинах інших локалізацій: підвищена експресія MMП-2 і MMП-9 виявлялася при інвазивних карцинома голови і шиї, експресія TIMР-2 корелювала з локальної інвазією пухлини. Прогностична важливість рівнів ММП-2 була описана у хворих на рак простати, а рівнів ММП-2 і ММП-9 - у хворих на рак шлунка і у хворих на рак гортані. ММП-7 - основна МЕТАЛОПРОТЕАЗ, що продукуються клітинами аденокарциноми стравоходу, і її експресія характеризує агресивні інвазивні пухлини. ММП-11 в даний час вважається маркером прогресії пухлини ободової кишки і раку молочної залози, її присутність свідчить про поганий прогноз захворювання. Зворотна кореляція спостерігалася між рівнями експресій TIMP-2, TIMP-3 і стадією пухлинного процесу в пухлинах гіпофіза.
Таким чином, в даний час безперечною є роль молекул адгезії не тільки в процесах ембріонального розвитку, запалення, імунної відповіді, формування тромбу, апоптозу, росту, регенерації, але також і у виникненні рецидивів і метастазуванні пухлинних утворень.