Головна | Про нас | Зворотній зв'язок
РЕАКЦІЇ ОСАДЖЕННЯ БІЛКІВ
Більшість білків відносяться до високомолекулярних сполук, які добре розчиняються у воді. Розчинення білків у воді пов'язано з гідратацією його молекул і утворенням навколо частинок білка гідратної оболонки. Будь-які фізичні та хімічні фактори, що порушують гідратацію молекул білка і нейтралізують їх заряд, призводять до зниження розчинності білка і сприяють випаданню його в осад.
1. Осадження білків при нагріванні.
Вплив високої температури веде до теплової денатурації білків, в результаті якої порушується вторинна, третинна і четвертинна структури білка. Згортання більшості білків починається при температурі 50-55 0 С. При короткочасному нагріванні денатурація може і не відбутися або проявиться в слабкому ступені, подальше ж підвищення температури веде до швидкого згортання білка.
На швидкість і інтенсивність процесу теплової денатурації дуже впливають рН розчину і присутність електролітів. Швидко і найбільш повно білки згортаються в ізоелектричної точці. У сильно кислих і в сильно лужних розчинах осадження білків при кип'ятінні практично не відбувається, так як молекули білка набувають позитивний або негативний заряди відповідно.
Реактиви: водний розчин яєчного білка, 1 і 10% -ні розчини оцтової кислоти, 10% -ний розчин гідроксиду натрію, насичений розчин хлориду натрію.
Виконання роботи. О п'ятій пробірок наливають по 1 мл розчину білка. Білок в першій пробірці нагрівають до кипіння, при цьому розчин мутніє, але осад не випадають.
До розчину білка в другій пробірці додають одну краплю 1% -ного розчину оцтової кислоти і нагрівають, при цьому випадає пластівчастий осад білка.
До розчину білка в третій пробірці додають 5 крапель 10% -ного розчину оцтової кислоти і нагрівають до кипіння, при цьому осад не утворюється.
У четверту пробірку додають 5 крапель 10% -ного розчину оцтової кислоти і 6 крапель насиченого розчину хлориду натрію, нагрівають до кипіння - білок випадає в осад.
У п'яту пробірку додають 5 крапель 10% -ного розчину гідроксиду натрію і нагрівають до кипіння, при цьому осад не випадають.
Пояснити явища, якщо відомо, що до складу яєчного білка входять: яєчний альбумін з рНІЕТ = 4,8 і яєчний глобулін з рНІЕТ = 6,6.
Осадження білків органічними розчинниками.
Органічні розчинники (спирт, ефір, ацетон і ін.) Руйнують гідрадну оболонку білка, що призводить до зниження його стійкості і випадання білка в осад.
Осадження білків етанолом оборотно при короткочасному впливі реагенту і без нагрівання. Тривалий контакт білка зі спиртом призводить до незворотної денатурації.
Реактиви: розчин яєчного білка, етиловий спирт, ацетон.
Виконання роботи. До 1 мл розчину білка додають 2 мл етилового спирту і збовтують. Випадає осад білка, який знову розчиняється при розведенні водою.
До 1 мл того ж розчину білка додають 2 мл ацетону і енергійно струшують. Розчин білка мутніє.
Осадження білків мінеральними кислотами.
Концентровані мінеральні кислоти (азотна, сірчана, соляна) викликають дегідратацію білкових частинок і нейтралізацію їх заряду, при цьому можливе утворення комплексних з'єднань. Все це призводить до необоротною денатурації білка. Осад білка, отриманий під дією кислот, в надлишку сірчаної та соляної кислоти розчиняється, але не розчиняється в надлишку азотної кислоти.
Реактиви: розчин яєчного білка, концентровані розчини соляної, сірчаної та азотної кислот.
Виконання роботи. У три пробірки наливають по 1 мл розчину кислот: в першу - соляної, в другу - сірчаної, в третю - азотної. Обережно по стінці пробірки, щоб рідини не змішувалися, доливають рівний об'єм розчину білка. На межі двох рідин утворюється осад у вигляді невеликого кільця. Пробірки обережно струшують, додають надлишок кислот і спостерігають розчинення опадів в перших двох пробірках.
Осадження білків солями важких металів.
Білки осідають солями свинцю, ртуті, срібла, міді та інших важких металів. В цьому випадку денатурація білка викликається адсорбцією іонів важких металів на поверхні білкових молекул з утворенням нерозчинних комплексів.
Надлишок деяких солей (сульфату міді, ацетату свинцю та інших) веде до розчинення осаду (пептізаціі).
Реактиви: розчин яєчного білка, 1% -ний розчин сульфату міді, 5% -ний розчин ацетату свинцю, 1% -ний розчин нітрату срібла.
Виконання роботи. У три пробірки наливають по 1 мл розчину яєчного білка і по краплях додають розчини солей: в першу - сульфату міді, в другу - ацетату свинцю, в третю - нітрату срібла до випадання опадів. Потім додають надлишок солей і спостерігають розчинення опадів в перших двох пробірках. Осад, утворений нітратом срібла, не розчиняється у надлишку солі.
Осадження білків нейтральними солями (висолювання).
Випадання білків в осад при дії на них розчинів нейтральних солей амонію, лужних і лужноземельних металів називається висолюванням. Цей процес заснований на дегідратації білків і нейтралізації зарядів білкових частинок адсорбує на них іонами солі. При цьому білкові розчини втрачають стійкість, частки білка злипаються і випадають в осад.
Змінюючи концентрації солей, можна виділити різні білкові фракції. Так, в разі висолювання хлоридом натрію, глобуліни (pHІЕТ = 6.6) осідають насиченим розчином солі, а для осадження альбумінів (pHІЕТ = 4.8) необхідно додати 1% -ний розчин оцтової кислоти для нейтралізації заряду білка.
Реактиви: розчин яєчного білка з хлоридом натрію, кристалічний хлорид натрію (тонко розтертий порошок у вигляді пудри), 1% -ний розчин оцтової кислоти, 1% -ний розчин гідроксиду натрію, 1% -ний розчин сульфату міді.
Приготування розчину білка (з додаванням хлористого натрію).
Білки трьох курячих яєць відокремлюють від жовтків, розчиняють в 7 мл дистильованої води і доливають 3 мл насиченого розчину хлориду натрію. Розчин фільтрують через марлю, складену в 3-4 шари. Зберігають в холодильнику.
Виконання роботи. У пробірку наливають 3 мл розчину яєчного білка і додають до отримання насиченого розчину порошок хлориду натрію. Через 5-6 хвилин в пробірці спостерігається випадання осаду глобулінів. Альбуміни з нейтральних розчинів солей лужних і лужноземельних металів не осідають. Вміст пробірки фільтрують через паперовий фільтр.
У фільтраті залишаються альбуміни, для їх осадження розчин підкислюють 1% -ним розчином оцтової кислоти. З'явився осад відфільтровують, а в фільтраті за допомогою биуретовой реакції доводять відсутність білка.
1. Дайте поняття нативного білка.
2. Які фактори впливають на розчинність білків?
3. Що відбувається при оборотному і незворотному осадженні білків?
4. Якими реактивами викликається необоротне осадження білків?
5. Які органічні розчинники викликають осадження білків з розчинів і чому?
6. Як впливає Ізоелектрична стан на осадження білків при нагріванні?
7. Які фактори викликають денатурацію білків і чому?
8. Чому при тепловій денатурації яєчного білка в сильно кислому або сильно лужному середовищі білок не випадає в осад навіть при нагріванні?
9. На чому грунтується поділ альбумінів і глобулінів?
10. На чому заснований метод висолювання білків?
11. Запропонуйте спосіб осадження білків: пепсину (рНІЕТ = 1,1), уреази (рНІЕТ = 4,9), каталази (рНІЕТ = 6,7).
12. На чому грунтуються методи вилучення білків?