Слід мати на увазі, що при вирощуванні культур клітин необхідно виключити їх контамінацію бактеріями, грибами і вірусами. Для цього при роботі з ними потрібно дотримуватися найсуворішу стерильність, а від вірусної контамінації позбавляються шляхом використання SPF донорів.
Культури клітин з тих чи інших тканин або органів отримати нескладно. Але ця технологія вимагає скрупульозності, обережності, визначених прийомів і навичок. Клітини з тканин вивільняють шляхом роздрібнення і впливом трипсину, папаина, колагенази, еластази, мукази і т.д. Але найбільш придатний для отримання культур клітин очищений трипсин. У подрібнену тканину поміщають дуже слабо концентрований (0,25%) трипсин, який руйнує міжклітинний речовина, що сприяє розділенню клітин. Застосовуючи електромагнітну мішалку, центрифугу і багаторазово промиваючи клітинну суспензію, отримують маткову основу живих клітин, яку поміщають у відповідну живильне середовище. Потім вирощують культуру клітин в термостаті при температурі 37 ° С і через 3-4 діб отримують готову культуру клітин. Наявність зростання клітинної культури визначають під мікроскопом. Нормально зростаюча культура клітин під мікроскопом представлятиме один шар клітин, впритул прилеглих одна до одної, і мають типову для даної культури морфологію. При зміні температури, рН середовища ріст клітин сповільнюється культура клітин може загинути.
Для отримання культури клітин застосовуються так звані ростові середовища, що містять білок сироватки крові певних тварин, гідролізат лактоальбумін і т.д.
Час генерації різних культур клітин становить 15-50 год. Після досягнення певного, гарного росту, подальше їх розмноження припиняють. Така культура клітин може використовуватися для вирощування в ній вірусів (рис. 2).
Тканина плоду або дорослої особини
Мал. 2. Отримання клітинних ліній при культивуванні in vitro
соматичних клітин (по Гріффітс Дж. Б. 1989)
Наведемо конкретний приклад отримання клітинної культури з нирок телят (ПТ), яка застосовується вирощування вакцинного авірулентние штаму ТК-А (ВІЕВ) вірусу інфекційного ринотрахеїту (ІРТ) великої рогатої худоби. Для отримання культури клітин ПТ використовують нирки від теля віком 1-1,5 місяці. З нирок знімають капсулу, подрібнюють ниркову тканину до шматочків величиною 3-5 мм, ретельно промивають розчином Хенкса з антибіотиками. Подрібнену тканину переносять в стерильну колбу і заливають її 0,25% розчином трипсину в співвідношенні 1:10 -1: 15. Дезагрегацію тканини проводять дрібно із застосуванням магнітної мішалки при температурі 35-37 ° С до повного виснаження тканини. Для цього проводять 7-8 циклів по 10-15 хв кожен. Вихід клітин з одного грама ниркової тканини становлять 40-50 млн.
Для вирощування клітин ПТ використовують ростові середу з гідролізату лактоальбумін з додаванням 10% нормальної сироватки крові великої рогатої худоби. У цю середу вносять посівну дозу ПТ в концентрації 600-800 тис. Клітин / мл. Культивування клітин ПТ здійснюється в матрацах при температурі 37 ° С. Моношар клітин формується на 5-ту добу. Зміну ростовой середовища проводять на 2 -3-й добі. Контроль якості культури здійснюють макро- і мікроскопічно.
Після формування моношару культуру клітин відмивають розчином Хенкса двічі, видаляючи тим самим сироватковий білок, що перешкоджає репродукції вірусу після внесення його в культуру клітин.
В даний час все культури клітин, які використовуються для вирощування і накопичення вірусів можна розділити на наступні основні групи:
- первинна культура - така культура клітин, для якої використані клітини, органи або тканини, взяті безпосередньо з організму;
- субкультура - клітини «первинної культури», піддані субкультівірованія;
- клітинна лінія - культура клітин, отримана з субкультури;
- диплоидная клітинна лінія - лінія клітин, 75% яких мають каріотип, властивий нормальної клітині організму, з якого вони виділені;
- перевивається (стабільна) клітинна лінія - безсмертна культура диплоїдних клітин, яка в результаті трансформації придбала здатність до необмеженої кількості пасажів (не менше 70 разів з 3-денним інтервалом);
- гетероплоідная клітинна лінія - лінія клітин, яка містить менше 75%) диплоїдних клітин. Такі клітини не мають ознаки новоутворень. У той же час вони не мають обмежень можливості збільшення in vitro.
За частотою використання клітинних культур вони поділяються на первинні (періодичні) і перещеплюваних (постійні). Перші використовуються, як правило, одноразово, тобто в технологічному процесі вони використовуються одноразово. Другі є безперервними, постійними клітинними лініями, які в технологічному процесі використовуються багаторазово.
Субкультівірованія клітин, а потім і становлення постійної клітинної лінії були успішними, коли первинну однослойную культуру отримували шляхом посіву механічно подрібненої суспензії трипсінізірована клітин.