Головна особливість Resident Evil Zero - нововведення під назвою «partner zapping» - дозволяє не вибирати, як це було раніше, одного головного персонажа і проходити їм всю гру, а контролювати обох персонажів протягом всієї гри, в будь-який момент перемикаючи управління з одного персонажа на іншого.
Обидва персонажа можуть рухатися разом, при цьому веденим буде керувати комп'ютер; або вони можуть розділитися, щоб в один і той же час обшукати різні локації. У грі зустрічається кілька головоломок, успішне вирішення яких можливе лише при такому способі управління. Кожен з персонажів має свої особливості: Ребекка - медик, і здатна готувати лікарські препарати із знайдених трав. Крім того, вона може проникати у важкодоступні місця, однак, її здоров'я слабкіше. Біллі може переносити важкі предмети, має в арсеналі запальничку, володіє великим, ніж Ребекка, здоров'ям, але не здатний змішувати трави.
Також в грі збережена традиція, коли всі знайдені предмети можна скласти на зберігання в ящик, доступ до якого є в протягом всієї гри. Тепер гравець може в будь-якому місці викинути що-небудь зі свого інвентарю щоб звільнити місце для буде придбане предмета. Надалі викинутий предмет можна знову підібрати, а карта гри підказує, де і які предмети кинуті.
Ребекка виявляє, що зупинився експрес кишить зараженими людьми - зомбі. Переживши перший кошмар від зустрічі з ними, вона знаходить вижила - хлопця на ім'я Біллі Коен, колишнього морського піхотинця, якого перевозила знайдена в лісі машина. Тепер Ребекка і Біллі стають однією командою і слідують далі разом, захищаючись від атакуючих монстрів: зомбі, мутованих собак, п'явок і величезного мутанта-скорпіона. Раптово поїзд починає рух і набирає небезпечну швидкість. Ребекка і Біллі використовують стоп-кран і залишають склад. Перед ними постає занедбаний тренувальний комплекс.
Двоє персонажів обходять комплекс, відбиваючи атаки зомбі і істот, що з'явилися в ході експериментів корпорації «Umbrella»: гігантських комах, павуків-мутантів, приматів і все тих же п'явок. В ході проходження Коен розповідає про своє минуле. Його загін проти власної волі був відправлений на знищення ні в чому не винних цивільних осіб в африканській селі в охопленій громадянською війною країні. Незабаром стало відомо, що наказ знищити цивільних грунтувався на неправдивої інформації, а значить, був злочинним.
Потім Ребекка і Біллі дізнаються, що колишній господар комплексу, Джеймс Маркус, за участю Озвелла Е. Спенсера і Едварда Ешфорд зробили фундаментальне відкриття - вірус-прабатько. Змішавши відкритий ними вірус з вірусом Ебола. вони отримали агент, здатний викликати негайну мутацію зараженого організму. Єдиним серйозним недоліком вірусу була вкрай висока світлочутливість. згубна для вірусу. Спочатку Ешфорд хотів застосовувати відкритий ними вірус в медицині, використовуючи його потужні регенеративні властивості, але після його смерті Спенсер і Маркус почали вивчати можливості застосування вірусу як біологічна зброя. Скомбінувавши вірус з ДНК п'явки, вони отримали Т-вірус, що перетворює заражених в зомбі.
Вибравшись з будівлі і здолавши у дворі гігантську кажана, Ребекка і Біллі знаходять підземну лабораторію Маркуса. Там вони дізнаються нову інформацію про створення Т-вірусу і виявляють, що Маркус продовжував свої експерименти навіть після своєї офіційної пропажі. У підземеллі Біллі Коен піддається атаці зараженого Т-вірусом примату і пропадає в каналізаційний системі. Ребекка вирушає на його пошуки і потрапляє в підземний дослідний комплекс корпорації «Umbrella». Там вона зустрічає іншого члена команди «Браво» - командира Енріко Маріні, який повідомляє, що решта бійців загону зараз знаходяться в якомусь особняку, що раніше належало Озвелу Спенсеру. Однак шляхи Енріко і Ребекки розходяться, так як Ребекка вирішує спочатку знайти Біллі. Розлучившись з Енріко, вона бореться з звільнилися Тираном Т-001 (найпершої експериментальною моделлю проекту «Тиран»). Потім, спустившись в очисні споруди, що використовувалися для знищення біологічних відходів, знаходить там зниклого Біллі.
Возз'єднавшись, герої рухаються до виходу. По дорозі вони зустрічають Маркуса. Він розповідає їм, що ні Альберт Вескер, ні Вільям Біркін не мають ніякого відношення до вирвався на свободу вірусу, який погубив залізничний експрес і особняк в горах. Вся вина лежить на ньому, Маркус, який працював на корпорацію «Umbrella» до того моменту, поки десять років тому його колишні учні Альберт Вескер і Вільям Біркін не вбили його за наказом керівника корпорації Спенсера, який став бачити конкурента в Маркус. Вмираючи, Маркус впровадив в своє тіло заражену Королівську п'явку, що дозволило йому «воскреснути» і зберегти пам'ять про свого колишнього життя. Тепер Маркус перетворився в масу п'явок, яка почала переслідувати героїв. В цей час Вільям Біркін і Альберт Вескер, як і раніше працювали на «Umbrella», також вирішують діяти. Вескер відправляється в особняк Спенсера, а Біркін активує механізм знищення тренувального комплексу.
Ребекка і Біллі вступають в фінальне бій з мутировавшей формою Маркуса - Королівської п'явки. Здолати монстра їм допоміг яскраве світло тільки що зійшло, чиї промені впали через відкритий зсувний стелю лабораторії. Ребекка кидає Біллі револьвер, а останній остаточно вбиває Королівську П'явку.
Комплекс вибухає, Ребекка і Біллі вибігають на вершину скелі, звідки відкривається вид на особняк Спенсера, в якому відбудуться події першої частини Resident Evil. Герої віддають один одному військову честь. Ребекка заявляє, що відтепер Біллі Коен офіційно числиться загиблим. Кожен йде своєю дорогою, Ребекка - у напрямку до особняка, в надії дізнатися про долю членів команди «Браво». Але це вже події першої частини Resident Evil.
На відміну від раніше випущених ігор серії, де Capcom, як правило, змінювала багато в сценаріях ігор під час їх виробництва, в Resident Evil Zero сценарій і установки практично не зазнали жодних змін в процесі виробництва. Одним з небагатьох змін стало те, що в первісній версії Ребекка носила на голові червону бандану. а в тій, що вийшла в результаті на GameCube, на Ребекку надітий бере. Таким чином, Ребекка знайшла такий же зовнішній вигляд, який вона має в рімейку Resident Evil. незадовго до цього вийшов на GameCube.
Гра була добре сприйнята критиками і розійшлася по світу накладом у 1,25 млн копій.
- Ребекка Чемберс - Наймолодший член команди «S.T.A.R.S. Bravo », медик, ледь надійшла на службу.
- Біллі Коен - Засуджений за військовий злочин, якого не скоював, один з головних героїв. Його перевозили на вантажівці для здійснення страти, але вантажівка зазнав нападу і Біллі втік.
- Альберт Вескер - Капітан відділення «S.T.A.R.S.» в Раккун-Сіті. Насправді він подвійний агент, що працює на корпорацію «Umbrella» і один з керівників проекту зі створення смертоносного Т-вірусу.
- Вільям Біркін - Один з творців Т-вірусу. Молодий учений, він одержимий своїми експериментами і готовий заради їх здійснення йти до кінця.
- Джеймс Маркус - Один з творців «Umbrella». Одного разу його вкусила інфікована Т-вірусом п'явка і з тих пір Маркус має необмежену владу над п'явками. Головний ворог в грі.
- Енріко Маріні - Командир «S.T.A.R.S. Bravo ».
- Едвард Дьюї - Пілот вертольота команди «S.T.A.R.S. Bravo ».