Рестрикції ДНК (латинське restrictio - обмеження) називається процес ферментативного поділу ланцюжків дезоксирибонуклеїнової кислоти на окремі фрагменти, що представляють собою послідовність нуклеотидів різного розміру.
Цей процес є частиною одного з найважливіших внутрішньоклітинних захисних механізмів від проникнення і вбудовування в геном чужорідного генетичного матеріалу. Він контролюється складною системою клітинної регуляції. Іншою стороною застосування цього явища є синтетична генна інженерія, яку не можна було б уявити без можливості розділяти ДНК-матеріал на фрагменти.
Історія вивчення
Механізми рестрикції усередині системи захисту клітини нерозривно пов'язані з механізмом модифікації, і починаючи з середини
У 1970р. дослідники Сміт і Вількокс виділили з гемофільної палички першу рестріктази, яка могла розщепити тільки специфічні послідовності ДНК.
В подальшому було відкрито більше 500 різних рестрикційних ендонуклеаз, які розпізнають, прикріплюються, розщеплюють різні послідовності дезоксирибонуклеїнової кислоти.
Механізм дії
Всі ендогенні рестріктази високоспецифічні. Вони чітко розпізнають певний ланцюжок нуклеотидів, але можуть «розрізати» її по-різному. Як правило, пізнається коротка послідовність з 4 - 6 підстав.
Особливістю процесу рестрикції-модифікації є захист власної ДНК від сайт-специфічної ендодезоксірібонуклеази (рестріктази) за допомогою метилювання. Цей процес здійснюється ферментами метилаз, також діючими вибірково до азотистих підстав, розташованим в певному порядку, і що додають до них метильние групи, роблячи сайт молекули дезоксирибонуклеїнової кислоти стійким до рестрикції.
Виділяють три особливих класу рестриктаз. Вони відрізняються за кількома ознаками: будовою, точкам застосування.
Рестріктази другого класу мають окрему двухбелковую структуру, відрізняючись від першого і третього класів зі складною будовою і АТФ-залежністю, що дозволяє використовувати їх для генної інженерії. Фермент другого класу складається з двох діючих частинок: рестріктірующей ендонуклеази, що модифікує метилаза, які діють тільки разом з іонами магнію.
Завдяки досягненням молекулярної біохімії, вчені змогли виділити понад п'ятсот специфічних рестриктаз другого класу. Але як з'ясувалося по ходу досліджень, деякі з них діють на однакові послідовності нуклеотидів. Такі ферменти отримали назву - ізошізомери. Справжні ізошізомери ділять сайт ДНК по одній точці, а гетерошізомери, вибираючи однаковий сайт, здійснюють рестрикцию в різних його місцях.
Як вже було зазначено, рестріктази частіше виділяють послідовність з 4 або 6 азотистих основ, а тому, в залежності від кількості, діляться на дрібно- і крупнощемящіе.
Ендогенна рестриктаза розпізнає певну послідовність ДНК - сайт впізнавання. У більшості випадків він є паліндромом, тобто порядок розташування нуклеотидів однаковий при читанні справа наліво і зліва направо. Наприклад, 3'-AGATCT-5 'або 5'-TCTAGA-3'.
Фермент міцно зв'язується з впізнаним поруч азотистих основ, а потім при русі ланцюжків молекули «знаходить» сайт розрізання.
Рестрикція можлива з утворенням тупих (blunt) і липких (sticky) кінців. Тупі кінці утворюються, якщо рестриктаза ділить ланцюжка ДНК один навпроти одного. А липкі кінці характеризуються утворенням коротких і довгих хвостів (3', 5'-кінців) через несиметричного розрізання палиндромов. Липкі кінці самокомплементарни, тобто здатні відновити структуру при з'єднанні.
Необхідність вивчення механізмів рестрикції
Вивчення процесів рестрикції істотно спростило дослідницьку діяльність, так як з її допомогою стало можливим поділ одиниці генетичного матеріалу на невеликі частини.
За допомогою фізичних методів (електрофорез з агарози) фрагменти можна розділити за розміром, а потім вивчити кожен окремо, побудувавши рестрикційні карти.
Практичне застосування в медицині і генетиці
Якщо дещо спростити і схематично відобразити алгоритм дій генної інженерії, то ми отримаємо наступне: спочатку
Розщеплення ДНК (рестрикция) є основою генетичної інженерії і знаходить своє застосування в безлічі щодня проведених досліджень. На основі нуклеотиднихпослідовностей, отриманих при поділі ланцюжків різних молекул, створюються штучні рекомбінантні ДНК, які знаходять широке застосування в багатьох галузях людського життя. Значна кількість наукових робіт присвячені дослідженню можливості лікування таких непереможних на сьогодні захворювань як ВІЛ-інфекція, пухлини та ін. Наприклад, шляхом приєднання до генів, які кодують білки-рецептори заражених вірусом клітин, іншого гена, який сприяє синтезу рослинного отрути, порушується процес біосинтезу білка в цитоплазмі, що веде до їх загибелі. У перспективі можуть бути знайдені підходи до лікування безлічі спадкових вроджених і набутих захворювань, причому на самому ранньому етапі - на молекулярному, субмолекулярном рівнях.
Відомі дослідження в області фармацевтики, що покращують характеристики вироблених ліків і способи їх доставки до клітин, тканин організму.
Зробила великі кроки вперед трансплантологія, дозволяючи вирощувати донорські органи в різних тварин або навіть просто в пробірках з живильними середовищами, при цьому виключаючи ензимна несумісність завдяки генній модифікації.
Перспективи розвитку
Генетична інженерія надає величезні можливості в питаннях поліпшення існуючих організмів або створення нових, здатних істотно підняти продуктивність біотехнологічних процесів, примножити їх господарську цінність для людини.
Генетично модифіковані продукти міцно влаштувалися в нашому житті, і, незважаючи на деякі скептичні думки експертів, більшість вчених схиляється до висновку, що за ГМО коштує майбутнє в питаннях продуктового забезпечення людства.
В подальшому вченим можуть відкритися нові горизонти для досліджень метаболізму, уповільнення процесів старіння, розробки і використання новітніх біонанотехнологій стосовно до людського організму.
Цікавий факт про рестрикції
Вчений Ренді Люїс (до слова, великий шанувальник Людини-павука) провів рестрикцию генома павука, виділивши фрагменти, що відповідають за виробництво каркасної павутини (найміцнішою), а потім вмонтував їх в гени вироблення молока у кіз. Результатом стала поява козенят, що виробляють молоко і павутину.