15.7.8.2. Основні етапи промислового одержання антибіотиків
Процес отримання антибіотика включає в себе чотири основні стадії (рис. 15.7.23) [145]: отримання відповідного штаму - продуцента антибіотика, придатного для промислового виробництва; біосинтез антибіотика; виділення і очищення антибіотика; концентрування, стабілізація антибіотика і отримання готового продукту.
Мал. 15.7.23. Схема виробництва антибіотиків в процесі мікробного біосинтезу
Отримання продуцентів антибіотичних речовин [145]
Перше завдання при пошуку продуцентів антибіотиків - виділення їх з природних джерел. Разом з тим для цих цілей широко застосовується метод зміни геному виділеного продуцента антибіотика шляхом мутагенезу та генної інженерії.
В основу більшості прийомів виділення продуцентів покладено принцип виділення чистої культури мікроба і безпосереднього випробування його по відношенню до використовуваних тест-організмів.
Більшість сапрофітних бактерій добре розвивається на багатих за складом натуральних середовищах (мясопептонний агар, картопляний агар, сусло-агар та ін.) При рН близько 7,0 і температурі 30-37 ° С. У цих же умовах розвиваються актиноміцети і деякі гриби, але для них вони менш сприятливі, ніж для бактерій.
Актиноміцети ростуть повільніше, ніж бактерії; вони можуть використовувати такі джерела живлення, які не дуже добре засвоюються бактеріями. Для виділення актиноміцетів рекомендуються середовища, наведені в табл. 15.7.112. Значення рН середовища після стерилізації встановлюється в межах 6,8-7,1.
Міцеліальні гриби краще розвиваються на середовищах з дещо пониженим значенням рН (4,5-5,0), на яких погано ростуть багато бактерії і актиноміцети. Для виділення міцеліальних грибів можна рекомендувати середовища, наведені в табл. 15.7.113.
Вплив умов культивування на біосинтез антибіотиків [145]
До числа найбільш істотних факторів, що впливають на прояв антибіотичних властивостей мікроорганізмів, відносяться склад середовища, її активна кислотність, окислювально-відновні умови, температура культивування, методи спільного вирощування двох або більшого числа мікроорганізмів і інші фактори.
Середовища для культивування мікроорганізмів. Натуральні (комплексні) середовища, що складаються з природних сполук і мають невизначений хімічний склад (частини зелених рослин, тваринні тканини, солод, дріжджі, фрукти, овочі, гній, грунт і т. Д.), Містять всі компоненти, необхідні для росту і розвитку мікроорганізмів більшості видів. Використовуються такі середовища:
- мясопептонний середовище, в склад якої одночасно з м'ясним екстрактом і пептоном входять хлорид натрію, фосфат калію, іноді глюкоза або сахароза; використовується зазвичай в лабораторній практиці;
- картопляні середовища з глюкозою і пептоном, часто використовувані в лабораторії для культивування багатьох видів актиноміцетів і бактерій;
- середовища з кукурудзяним екстрактом, соєвим борошном, бардою і іншими речовинами, до складу яких входять сульфат амонію, карбонат кальцію, фосфати, глюкоза, сахароза, лактоза або інші вуглеводи і ряд інших сполук; середовища успішно застосовуються в промисловості, т. к. є дешевими і забезпечують хороше розвиток мікроорганізмів з високим виходом антибіотиків.
Оскільки натуральні середовища не дозволяють отримувати суворі кількісні дані для вивчення фізіологічних і біохімічних особливостей організму, застосовують синтетичні середовища, які підбирають для окремих продуцентів індивідуально. Синтетичні середовища можуть бути як відносно простими, так і складними, для складання яких використовують методи математичного планування експерименту.
Джерелами вуглецю можуть бути органічні кислоти, спирти, вуглеводи, поєднання різних вуглецевмісних сполук (табл. 15.7.114).
Вплив джерела вуглецю на зростання B. brevis subsp. G.B.
і біосинтез граміцидину (48 год культивування) [145]
Біомаса, мг / 100 мл
При промисловому одержанні ряду антибіотиків в якості джерел вуглецю нерідко застосовують картопляний крохмаль, кукурудзяне борошно або інші рослинні матеріали. Однак не всі продуценти мають досить активними амілазами, здатними здійснювати гідроліз крахмалсодержащего сировини. Попереднє осахаривание крахмалсодержащих матеріалів за допомогою ферментів значно полегшує використання мікроорганізмами цих матеріалів.
Джерела азоту дуже впливають на освіту мікроорганізмами антибіотичних речовин. Зазвичай в середовищах для культивування мікроорганізмів джерелом азоту служать солі азотної (рідше азотної) кислоти, амонійні солі органічних і неорганічних кислот, амінокислоти, білки і продукти їх гідролізу. Багато мікроорганізмів успішно використовують і окислені форми азоту, деякі з них потребують саме в нітратного джерелі азоту (Streptomyces auranticus. S. subtropicus і деякі інші). Ряд актиноміцетів іноді засвоюють краще нітрати, ніж амонійні солі; вони можуть використовувати навіть нітрити, якщо їх вносять в середу в невеликих кількостях (не більше 50 мг NaNO2 / 1 л середовища). При цьому засвоєння нітритів тісно пов'язане з джерелом вуглецю; наприклад в присутності гліцерину нітрити споживаються набагато краще, ніж в присутності глюкози. Використання амонію і деяких органічних джерел азоту пліснявими грибами поліпшується в присутності невеликих кількостей (0,1-0,2%) деяких дикарбонових (бурштинової і фумарової) кислот. У ряді випадків для накопичення антибіотика необхідна присутність і амонійного, і нітратного джерела азоту (біосинтез пеніциліну).
Зазвичай найбільш сприятливим для мікроорганізмів є співвідношення C. N = 20. Проте для освіти антибіотика таке співвідношення не завжди оптимально. Тому для кожного продуцента необхідно підбирати відповідне співвідношення вуглецю та азоту.
Джерелами мінерального живлення служать фосфор, сірка та інші макро- і мікроелементи.
Більшість мікроорганізмів легко використовують як джерела фосфору ортофосфати. Окремі види поряд з цим споживають і фітати (солі інозітфосфорних кислот).
Продуценти антибіотиків по відношенню до концентрації фосфору в середовищі можна розділити на три групи:
- високочутливі продуценти, для яких оптимальна концентрація фосфору в середовищі становить менше 0,01% (продуценти нистатина, тетрацикліну, флоримицина, ванкоміцину);
- продуценти середньої чутливості, для яких оптимальна концентрація фосфору становить 0,010-0,015% (продуценти стрептоміцину, еритроміцину, циклосерина, неоміцину);
- малочутливі продуценти, для яких оптимальна концентрація фосфору становить 0,018-0,020% (продуценти новобиоцин, граміцидину, олеандомицина).
Сірка входить до складу деяких антибіотиків, утворених грибами (пеніцилін, цефалоспорин, гліотоксін і ін.), Бактеріями (Бацитрацин, субтіліни, низини) і актиноміцетами (ехіноміціни, група тіострептона). Зазвичай джерелом сірки в середовищі служать сульфати. Однак при біосинтезі пеніциліну кращим джерелом сірки для продуцента служить тіосульфат натрію.
Крім того, для біосинтезу антибіотиків необхідні і окремі мікроелементи. Так, продуцент альбоміціна S. subtropicus утворює антибіотик при значній концентрації заліза в середовищі. Залізо необхідне для утворення хлорамфеніколу та інших антибіотиків.
Біосинтезу ряду антибіотичнихречовин (хлорамфеніколу, стрептоміцину, пеніциліну і ін.) Сприяють іони цинку.
Стимулюючий вплив на біосинтез гентаміцину, кураміціна А, фософономіціна надають іони кобальту.
Іони галогенів входять до складу деяких тетрациклінових антибіотиків і хлорамфеніколу.
Вплив рН середовища. Багато бактеріальні організми, які синтезують антибіотики, краще розвиваються при рН близько 7,0, хоча деякі, наприклад молочнокислі стрептококи, які продукують низин, краще розвиваються в середовищі при рН = 5,5 ÷ 6,0.
Більшість актиноміцетів добре розвиваються при початкових значеннях рН середовища в межах від 6,7 до 7,8; в більшості випадків життєздатність актиноміцетів при рН нижче 4,0-4,5 пригнічена.
Температура. Для більшості бактеріальних організмів температурний оптимум розвитку лежить в діапазоні 30-37 ° С. Для продуцента грамицидина С (B. brevis) оптимальна температура для розвитку і біосинтезу дорівнює 40 ° С.
Актиноміцети, як правило, культивуються при температурі 26-30 ° С, хоча деякі види стрептоміцетов можуть розвиватися як при знижених (від 0 до 18 ° С), так і при підвищених (55-60 ° С) температурах.
Для більшості міцеліальних грибів оптимальна температура становить 25-28 ° С.
Аерація. Більшість вивчених продуцентів антибіотиків є аеробами. Для біосинтезу багатьох антибіотиків (пеніцилін, стрептоміцин та ін.) Максимальне їх нагромадження відбувається при ступеня аерації, що дорівнює одиниці, при якій через певний обсяг середовища за 1 хв продувається такий же об'єм повітря.
В процесі розвитку продуцента антибіотика в промислових умовах потреба організму в кисні змінюється в залежності від стадії розвитку, в'язкості ЯЖ і інших чинників. На певних стадіях можуть виникнути ситуації, пов'язані з кисневим голодуванням продуцента. У цих умовах слід вживати додаткових заходів, наприклад, підвищення концентрації окислювача додаванням пероксиду водню.
Стадії розвитку продуцентів [145]
В умовах глибинної культури процес розвитку організму і синтезу антибіотика проходить у дві фази.
У першій фазі розвитку культури або, як її іноді називають, тропофазе (фаза збалансованого зростання мікроорганізму), спостерігається інтенсивне накопичення біомаси продуцента, пов'язане з швидким споживанням основних компонентів середовища і з високим рівнем поглинання кисню.
У другій фазі розвитку, іменованої ідіофазой (фаза незбалансованого зростання мікроорганізму), накопичення біомаси загальмовано або навіть зменшено. У цей період продукти метаболізму мікроорганізму лише частково використовуються на побудову клітинного матеріалу, вони в основному спрямовуються на біосинтез антибіотика. Зазвичай максимум продукції антибіотика в середовищі настає після максимуму накопичення біомаси.
Інтенсифікувати антібіотікообразованіе можна шляхом спільного культивування продуцента антибіотика з іншими спеціально підібраними видами мікроорганізмів.
Зокрема, штами продуцента трихотецин (Trichothecium roseum) найбільшу біологічну активність проявляють при спільному розвитку з мікроскопічними грибами роду Penicillium; вихід антибіотика підвищується в цьому випадку в кілька разів.
Збільшення освіти бацитрацину відбувається в тому випадку, якщо продуцент антибіотика B. subtilis культивується спільно з Pseudomonas sp.
Підвищення біосинтезу леворину культурою S. levoris спостерігається при спільному культивуванні актиномицета з дріжджоподібних грибів Candida tropicalis.
При спільному культивуванні двох мутантних штамів Streptomyces noursei, які втратили здатність до біосинтезу нистатина, антибіотик утворюється в тій же кількості, що і при розвитку вихідного активного штаму (табл. 15.7.115).
Освіта нистатина при спільному вирощуванні двох неактивних штамів St. noursei (4-е добу) [145]
Методи культивування продуцентів антибіотиків. Найбільш перспективним методом вирощування мікроорганізмів - продуцентів антибіотиків визнаний метод глибинного культивування з використанням періодичних процесів.
Виділення і хімічне очищення антибіотиків [145]
Залежно від того, де зосереджено антибіотичну речовину, застосовують відповідні методи його вилучення.
Якщо антибіотик знаходиться в ЯЖ, його виділяють методами екстракції, використовуючи для цього не змішується з водою розчинник, осаджують у вигляді нерозчинного з'єднання або сорбують іонітами.
З клітин мікроорганізмів антибіотик виділяють екстрагуванням органічними розчинниками. Якщо антибіотик міститься і в ЯЖ, і в клітинах продуцента, то спочатку його переводять в фазу, з якої найбільш доцільно видобувати цільове речовина.
Відділення розчину від біомаси і зважених часток проводять методами фільтрації або центрифугування.
Очищення антибіотика (відділення від домішок) здійснюється методами екстракції, іонообмінної сорбції та осадження. Після хімічної очистки антибіотик висушують, для чого застосовують Ліофільні сушку, висушування в розпилювальної сушарці, висушування в підвішеному шарі або в вакуум-сушильних апаратах