Сайт рестрикції. Рестріктаза. VNTR-поліморфізм.
Одним з перших був виявлений поліморфізм довжини рестрикційних фрагментів (ПДРФ). Про те, що таке ферменти рестрикції (рестріктази) і як вони діють, описувалося в розділі 7. Кожна рестриктаза розрізає молекулу ДНК, розпізнаючи специфічну для неї послідовність нуклеотидів, яку називають сайтом рестрикції.
Якщо в сайті рестрикції незалежно від того, де він знаходиться, виникає мутація і змінюється послідовність нуклеотидів, то рестриктаза не впізнає такий змінений сайт і не ріже в цьому місці молекулу ДНК. У той же час рестриктаза продовжує розрізати сусідні незмінені сайти рестрикції.
В результаті в мутантної ДНК один з фрагментів рестрикції виявляється довшим, ніж відповідні фрагменти в немутантний ДНК. Для того щоб виявити наявність поліморфного по рестрикції сайту в ДНК, після обробки рестриктазой її піддають електрофорезу.
Під час електрофорезу фрагменти ДНК розподіляються відповідно до своєї молекулярної масою. Зазвичай після рестрикції геномної ДНК утворюються сотні тисяч фрагментів. Ці фрагменти денатуруються, тобто перетворюються в од-нонітевие, їх переносять на нітроцеллюлезний фільтр, з яким вони міцно зв'язуються. Нагадаємо, що ця процедура називається блоттинга по Саузерну.
Оскільки деякі рестріктази розрізають ДНК досить часто, пошук поліморфізму можна вести за допомогою різних ДНК-зондів, попередньо мічених радіоактивним фосфором. Це можуть бути зонди до ділянок генів або будь-яким іншим послідовностей ДНК, локалізація яких відома.
Таким чином, можна виявляти мутації в генах, якщо ці мутації змінюють сайт рестрикції для певних рестриктаз. В даний час відомо сотні рестриктаз, які розпізнають різні послідовності нуклеотидів. У розпорядженні дослідників є тисячі ДНК-зондів до різних ділянок геному.
Використання цих можливостей призвело до виявлення багатьох тисяч поліморфних сайтів в людському геномі. В абсолютній більшості випадків ПДРФ є двухаллельную систему (наявність або відсутність сайту рестрикції), проте висока частота таких поліморфізмів була успішно використана при картуванні багатьох генів спадкових хвороб, в тому числі муковісці-доза, нейрофіброматозу 1-го типу та багатьох інших.
Значно більша кількість алелей, а отже, і більшу генетичну різноманітність, а також інформаційна цінність у ще одного типу ДНК-поліморфізму, який називають варьирующим числом тандемних повторів, або VNTR-поліморфізмом.
Описуючи різні типи ДНК, які зустрічаються в геномі людини, ми згадували мінісателлітние повтори. Ці повтори розкидані по геному, їх основна послідовність може включати до 80 нуклеотидів, а число повторів основної послідовності може варіювати в широких межах.
Виявлення VNTR-поліморфізму починається, так само як і виявлення ПДРФ, з розрізання геномної ДНК тій чи іншій рестриктазой, електрофорезу фрагментів, їх денатурації і блоттинга по Саузерну. Відмінність полягає в тому, що для гібридизації використовують ДНК-зонди, специфічні для певного мінісателітних повтору.