Ф. С. Кіржаев і Т. І. Бурмістрова
Всесоюзний науково-дослідний інститут по хворобах птахів (71) Заявник (54) СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ АНТИГЕНУ ДЛЯ ДІАГНОСТИКИ
Пуллороза - тифу ПТАХІВ і
Винахід відноситься до способів отримання діагностичних препаратів, зокрема препаратів, які використовуються дпя масової тріжізненной діагностики пуллороза-тифу птахів. 5
Відомі способи отримання діагностичних препаратів, що включають виділення антигенного фракції з мікробних клітин, у вигляді деградованого ппи негідрадірованного полісахариду або ліпопопісахарідного 10. Комплелса з подальшою сенсибілізацією нею формалінізірованпих еритроцитів (11.
Однак антигени, отримані відомим способом, проявляють високу серологічну активність тільки в реакції преціпіта- 15 ції і мало активні в інших видах серопогіческіх реакцій, які, зокрема, необхідні для діагностики пуллороза †"тифу птахів.
У птіпеводческой практиці дня серологі- 2в чеський діагностики пуплороза-тифу в польових умовах застосовується кольоровий корпускупярний пуллорний антиген.
Спосіб отримання кольорового пуплорного аптігена полягає в вирашнваніі злодій- 25 будителя пуллороза †".тіфа на живильному
"Реде, отриманні бактеріальної маси центріфугіроваііем, знепліднювання мікробних клітин формальдегідом з подальшим забарвленням їх аніліновими фарбами (2j.
Однак при здійсненні такого способу неможливо отримати високочутливий і специфічний антиген. Навіть багаторазові дослідження кольоровим пулпорним антигеном НЕ обеспечівакт виявлення всіх птіцносітелей збудника п лпороза-тифу в стаді. Осопенно низька діагностична цінність цього антигену при дослідженні птахів в ранньому віці. Крім того, прн дослідженні цим антигеном часті випадки неспепі рических реакцій у птахів. вільних від Збудника пуллореза †"тифу.
11овиспть чутливість цельноклеточной пуллорн pro антигену практично неможливо. 310 I6) c! I03rreHo Ht.riocTоя п им і дуже низьким рівнем агглютінінов в крові птахів, хворих і ллорозом †"тифом, а ін« тенснвность і чіткість видимої реакції аг гillOTHHQIIHII HQ СТеклi з IlerIÅõ × ÎÊËÐTÎ × .дим антигеном залежить т ькп від титру «гвЂ" глютінінов. Інші види циркулюючої антитіл, вступаючи в реакцію з бактеріальною клітиною, не викликають утворення макроскоціческі видимого комплексу антиген-антитіл (агглютіната), 5
Бель винаходи †"розробка способу отримання пуллорного антигену, який дозволяє отримувати високочувствітепьниі, специфічний і стабільний діагностику м, придатний для дослідження НТІЦ в полі- 10 вих умовах в будь-якому віці.
Зго досягається завдяки тому, що з отриманої бактеріальної маси виділяють полісахаридно-полипептидную фракцію і сечсібілізіруют нею формалінізірованних еритроцити барана.
Фоомалінізацію еритроцитів барана проводять 0,3% юним розчином формальдегіду протягом 14 год при 40 C.
Сенсибілізацію еритроцитів проводять 20 послідовно 45 хв при 80 С і 2 ч о при 40 С.
При такому способі отримують. найбільш активний і специфічний розчинний антиген †"полісахаридно-попілептідную фрак- 25 цію збудника .пуллороза вЂ" тифу для сенсибілізації еритроцитів барана, який вступає в макроскопічно видиму реакцію ні з одним видом антитіл (наприклад, агглютининами, зокрема з цельноклеточ 30 ним кольоровим пуллорним антигеном), а з усіма циркулюючої антитілами, сумарний титр яких в крові .больних птахів значно вище титру аглютинінів (наприклад в 16 разів) і не реагує з вйдонеспеціфіческімі; антитілами (наприклад з антитіл E.cob).
Консервація еритроцитів в 0,3% -ному розчині формапьдегіда на відміну від більш високих концентрацій (наприклад 1,5-3%), надійно консервуючи еритроцити, не змінює їх здатність сорбувати полісахаридно-полипептидную фракцію, а сенсибілізація формалінізірованних еритроцитів при
80 С забезпечує міцний зв'язок антигену з рецепторами еритроцитів і високу ступінь їх найнасиченим антигеном.
Приклад. Отримання 50000 доз антигену для прижиттєвої діагностики пупдороза - тифу птахів.
А. Отримання полісахаридно-поліпептід-. ної фракції збудника, пуллороза †"тифу.
Бактеріальну масу S. РМІ; і Um- аІмFute, вирощену на звичайних поживних середовищах, осаджують центрифугуванням при
5000 об / хв і двічі відмивають фізіологічним розчином при тому ж режимі центрифугування. Осад відмитої бактеріальної маси суспендують в 0,1 н. розчині крижаної оцтової кислоти до кон-. іентраціі 45 млрд. мікробних клітин в
1 мл по оптичному стандарту каламутності і ю екстрагують при 00-92; З протягом
60 хв. Гідропізат звільняють від бакте-, ріальних клітин центрифугуванням прн
6000 об / хв протягом 45 хв, діапізіруют проти водопровідної води до рН
5,0-5,5. Полісахаридно-попіпептідную фракцію осаджують з гідролізату 8-10 обсягами етанолу, відокремлюють центрифугуванням лрі 4000 зі / хв протягом 20 хв і розчиняють в дистильованої воді (рН 8,5-9,0) з розрахунку 10 г сухого вешества на 1 л води.
Редуцнруюшіх цукрів в перерахунку на глюкозу 300-315
Загального азоту 7 5-80
Остагочного азоту - 55-60. Білкового азоту 20-25
Б. Формапінізацня еритроцитів барана.
1. л крові барана в рівному обсязі розчину Опсевера центрифугируют при
10 обсягами буферного розчину.
В. Сенслбіл, зация формалінізірованних еритроцитів барана пелісахарідно-полнпептідной фракцією збудника пуллороза†"тифу.
На 1 л 1 0% -ної суспензії формалінізірованньФ еритроцитів на фосфатно-буферному розчині (рН 7,0-7, 2) додають 250-300 мп
1% -ного водного розчину полісахаріднополіпептідной фракції збудника пуплороза †"тифу, тшательно перемішують і підігрівають на водяній бані при 80 С протягом 45 хв, а потім переносять в термостат на 2 ч при 40 С.
Укладач Л. Мурая
Коректор П. Макаревич
Замовлення 770/30 Тираж 567 Передплатна
11НІІПІ Державного комітету Ради Міністрів СРСР у справах винаходів і відкриттів
113035, Москва, Ж-35, Раушской наб. д. 4/5
Філія ППП Патент r. Ужгород, вул. Проектна, 4
Осад сенсибілізованих і відмитих еритроцитів суспендують в буферному розчині до 10% -ної концентрації додають. мертіолат 1: 10000.
Пуллорний антиген, приготований
5 пропоновані м способом, зберігає активність і специфічність протягом року при
Результати дослідів свідчать про те, що пуллорний антиген, отриманий щ пропонованим спосооом, по чутливості перевершує відомий антиген в пробіркових реакції в 15-30 разів, а в умовах птахофабрик виявляє в 3-6 разів більше хворої птиці і не вступає в реакцію з відонеспеціфіческімі антитілами .
Висока чутливість і специфічність отриманого антигену дозволяє проводити дослідження птахів на пуллороз †"тиф в будь-якому віці, починаючи з 30-денного, що дуже важливо в сучасному промисловому птахівництві; в 2-3 рази скоротити терміни оздоровлення господарств від пуллороза-тифу; збільшити збереження курчат до
ЗО-денного віку на 1-2io і різко сни 2р зить витрати на лікарські препарати, що застосовуються з лікувально-профілактичною метою при вирощуванні птиці.
Методика дослідження птахів не змінюється в порівнянні з використовуваної для з- ЗО Укр антигену.
1, Спосіб отримання антигену для діагностики пуллороза - тифу птахів, що включає отримання бактеріальної маси збудника пуллороза †"тифу, про -т л і ч а ю ш і йс я тим, що, з метою підвищення чутливості і специфічності антигену, з nQлученной бактеріальної маси виділяють аолісахарідно-полипептидную фракцію і сенсибилизируют нею формалінізірованних еритроцити Оарай.
2.Способпоп. 1, отлічаюшійс я тим, що формалінізацію еритроцитів проводять 0,3% -ним розчином формальдегіду протягом 14 год. При 40 С.
3, Спосіб за пп. 1 і 2, про т л і ч а Юш і і з я тим, що сенсибілізацію формалінізірованних еритроцитів барана провоо дять послідовно при 80 С протягом
45 хв і при 40 С протягом 2 год.
4. Спосіб за п. 1, о т л і ч а ю ш і йс я тим, що полісахаридно-полипептидную фракцію виділяють шляхом гідролізу бактеріальної маси 0,1 н. розчином оцтової кислоти при 90-92 С в .теченіе 60 хв з подальшим осадженням її з гідролізату 8-10 обсягами етанолу.
Джерела інформації, прийняті до уваги під час експертизи;
1. Кебот E. Мейер М. Експериментальна імунохімія, М. "Медицина ° 1966, с. 124-128, 550-554.
2. Коваленко Я. P. Застосування біологічних і хіміотерапевтичних препаратів в ветевннарін, Ж. Селькоеіздат, 1951, с. 63.