Власники патенту RU 2320355:
Черних Людмила Єгорівна (RU)
Винахід відноситься до мікробіології і стосується отримання біомаси аутоштамма лактобактерій. Спосіб передбачає відбір проб нативного матеріалу. Посів проби не пізніше 2 годин з моменту взяття проби без розведення на селективну живильне середовище. Вирощують лактобактерії і виділяють чисту культуру лактобактерій, здійснюючи контроль отриманої біомаси лактобактерій. Проводять повторний пасаж виділених лактобактерій. Вирощують отриманий чистий культуру лактобактерій в селективної рідкому середовищі з подальшим додаванням консерванту, в якості якого використовують сахарозо-желатинову середу, в співвідношенні 1: 1 відповідно і контролем отриманої рідкої біомаси. Винахід дозволяє отримати рідку біомасу клітин лактобактерій зі спорідненою антигенною структурою до клітин кишечника споживача і підвищити якість отриманої біомаси.
Винахід відноситься до галузі мікробіології та медицини і стосується виготовлення біомаси аутоштамма лактобактерій рідкої, застосовуваної для корекції і підтримки мікробіоценозу кишечника і генітального тракту як з метою профілактики, так і для відновлення мікрофлори при дисбактеріозі.
Лактобактерії, що входять до складу нормофлори, виконують такі важливі функції, як участь у перетравлюванні і засвоєнні їжі шляхом активізації пристінкового травлення і утилізації харчових субстратів. Виробляючи в процесі життєдіяльності молочну кислоту, перекис водню, лізоцим, лактолин, виконують антагоністичну функцію по відношенню до патогенних і умовно-патогенних мікроорганізмів.
Лактобактерії відносяться до єдиним представникам нормофлори, переважною ріст і розвиток в кишечнику гнильних бактерій, а також збудників кишкових інфекцій, в тому числі збудників дизентерії та сальмонельозу.
Лактобактерії є основним мікробіологічними ланкою, що формує колонізаційної резистентність (захист) в шлунку і тонкому кишечнику.
Відомий спосіб отримання препарату для лікування шлунково-кишкових захворювань, який полягає в культивуванні штаму Lactobaccilus Bulgaricus в живильному середовищі, приготовленої з сої в анаеробних умовах при 35-42 # x000B0; С з подальшим висушуванням культури, додаванням цукру, грануляцією одержаної суміші і таблетированием ( а.с. СРСР №619187, опубл. 15.08.78 р).
Однак описаний спосіб пропонує застосовувати для лікування шлунково-кишкових захворювань тільки один вид лактобактерій, який не відноситься до однойменного виду лактобактерій кишечника споживача препарату (в даний час виділено і вивчено 67 видів лактобактерій) і не є його аутохтонной мікрофлорою. Відсутність на поверхні лактобактерій адгезінов, родинних клітин слизової шлунково-кишкового тракту, не сприяє приживлення, розмноженню і колонізації Lactobaccilus Bulgaricus.
Крім того, при прийомі бактерій, що знаходяться в стані спокою, яке досягається при тривалому заморожуванні і ліофільної сушінні, застосовуваних при виробництві препарату, необхідно час (2-3 доби) для відновлення активності бактеріальної клітини, що знижує ефект лікування.
Відомий спосіб виготовлення аутоштаммов біфідо-і лактобактерій, що включає в себе етапи забору випорожнень, вирощування бактерій і приготування біомаси з них (а.с. СРСР №1286212, опубл. 30.01.87 р).
Однак суспензія біфідо-і лактобактерій, приготована зазначеним способом, вимагає негайного застосування і не зберігається більше 2-3 діб, так як проводиться без застосування стабілізатора, який сприяє збереженню бактерій аутоштамма в активному стані більш тривалий час. Не проводиться контроль приготовленої суспензії на активність бактерій і відсутність сторонньої мікрофлори, що суперечить вимогам законодавчої документації і не захищає споживача від занесення при прийомі суспензії сторонньої мікрофлори.
Посів випорожнень проводиться після титрування досліджуваного матеріалу стерильним фізіологічним розчином, роблячи послідовно десятикратні розведення до 10 -8. Однак не проводиться посів з нативного матеріалу, що не представляє можливим отримати культуру біфідо-і лактобактерій при зниженні їх вмісту в кишечнику менш ніж 100 КУО в 1 г хімусу.
Найбільш близьким, прийнятим за прототип, є спосіб отримання банку аутохтонних штамів мікроорганізмів для відновлення кишкового мікробіоценозу людини (патент РФ №2126043, опубл. 10.02.99 р).
Даний спосіб включає в себе відбір проб фекалій, виділення аутоштаммов біфідобактерій, лактобактерій, ентерококів, кишкової палички, напрацювання біомаси, консервування та зберігання протягом життя людини. Періодично банк аутохтонних штамів поповнюється біомасою пізніх років життя. Раніше приготовані зразки аутоштаммов періодично (не рідше 1 разу на рік) піддаються контролю на активність і повторному процесу виробництва, якщо активність знижена більш нормативної.
Однак при виготовленні банку зразків роблять посів випорожнень з десятикратним розведенням після титрування стерильним фізіологічним розчином, минаючи етап посіву нативних випорожнень. При такій методиці виключається можливість отримання культур при зниженні їх числа в кишечнику менш ніж 100 КУО в 1 м
Вирощують і відбирають обмежене число видів біфідобактерій, лактобактерій, ентерококів, кишкової палички, хоча в даний час відомо, наприклад, одних тільки лактобактерій близько 67 видів. Таким чином, види лактобактерій, що не відносяться до вище перерахованим, в зразки не потрапляють.
Не проводиться контроль отриманих аутоштаммов на активність і відсутність сторонньої мікрофлори, що є невід'ємною частиною виробництва. Багаторазове повторення процесу ліофільної сушки одного і того ж раніше отриманого зразка аутоштамма призводить до зниження біохімічної активності і втрати здатності адгезіровать і колонізувати слизові оболонки шлунково-кишкового і генітального тракту.
Ректальне введення мікробної маси через зонд ускладнює процес прийому біомаси, не представляється можливим виробляти цю процедуру в домашніх умовах. Крім того, введені бактерії осядуть в товстому кишечнику, в той час як шлунок і тонкий кишечник, які містять в нормі від 10 3 до 10 4 КОЕ лактобактерій в 1 мл хімусу, заселення не піддавалося. А разом з тим лактобактерії є єдиними мікроорганізмами, що створюють захист слизової шлунка і 12-палої кишки від таких умовно-патогенних мікроорганізмів, як хелікобактер, які є причиною виникнення гастритів і виразкової хвороби шлунка.
Запропонований спосіб отримання банку аутохтонних штамів мікроорганізмів є дуже трудомістким, дорогим і доступним дуже обмеженому колу споживачів. Він також не може бути використаний в промисловому обсязі, тому що вимагає наявності великої кількості морозильних установок для зберігання раніше приготованих зразків, а також постійної роботи (не рідше 1 разу на рік) з кожним зразком біомаси аутоштамма.
Завданням, на вирішення якої спрямовано пропоноване винахід, є отримання рідкої біомаси з клітин лактобактерій зі спорідненою антигенною структурою клітин кишечника споживача, підвищення якості отриманої біомаси і збільшення терміну збереження активності клітин.
Технічним результатом є отримання рідкої біомаси з клітин лактобактерій зі спорідненою антигенною структурою клітин кишечника споживача, підвищення якості отриманої біомаси.
Технічний результат досягається тим, що спосіб отримання біомаси аутоштамма лактобактерій рідкої, який передбачає відбір проби нативного матеріалу, посів на селективну живильне середовище, вирощування лактобактерій, виділення лактобактерій, їх контроль, проведення повторного пасажу, вирощування отриманої культури лактобактерій в селективної живильному середовищі з наступним додаванням консерванту і контролем отриманої біомаси лактобактерій, відповідно до винаходу, початковий посів в селективну живильне середовище вироб одят без розведення нативного матеріалу, не пізніше двох годин з моменту взяття проби, до біомаси лактобактерій додають консервант, в якості якого використовують сахарозо-желатинову середу, в співвідношенні 1: 1 відповідно.
Між відмітними ознаками і досягається технічним результатом існує наступна причинно-наслідковий зв'язок.
Посів нативного матеріалу (випорожнень), без його розведення безпосередньо на селективну живильне середовище, в протягом 2-х годин з моменту взяття проби, дозволяє виділити лактобактерії навіть при незначній кількості їх у вмісті кишечника.
Повторний пасаж і вирощування отриманого чистого культури лактобактерії в селективної рідкому середовищі, з подальшим додаванням консерванту з розрахунку 1: 1 сприяє збереженню активності клітин протягом одного і більше місяців.
Проведення контролю отриманої рідкої біомаси гарантує її якість.
Пропонований спосіб здійснюють наступним чином.
Для отримання біомаси аутоштамма лактобактерії відбирають пробу нативного матеріалу (випорожнень) у конкретної людини. Не пізніше двох годин з моменту взяття проби здійснюють її посів, без розведення, на селективну живильне середовище, в якості якої використовують стандартну молочно-рослинну середу (МРС-4), що дозволяє виділити лактобактерії навіть при незначній кількості їх у вмісті кишечника, тобто менше 100 КУО в 1 г. при використанні найменшого розведення 10 -1 і посіві за методикою 0,1 мл можливе виділення лактобактерії при наявності їх у вмісті кишечника в кількості більше 100 КУО на 1 м Після виділення вивчають морфологічні, тінктор іального властивості виділеної культури, що підтверджують приналежність отриманих клітин до сімейства Lactobaccilacea. роду Lactobaccilus, тому що на молочно-рослинної середовищі можливе зростання інших бактерій, таких як стафілококи, гриби роду Candida, дріжджові клітини, подібних за характером росту з клітинами лактобактерій.
Проводять повторний пасаж виділених лактобактерій на селективну живильне середовище МРС-4 з метою вирощування чистих популяцій клітин, пасаж і вирощування полученнного чистої культури лактобактерій в селективної рідкому середовищі МРС-1, після чого додають консервант з розрахунку 1: 1 з метою збереження активності клітин протягом одного і більше місяців.
Проводять контроль отриманої рідкої біомаси на кількість життєздатних лактобактерій і відсутність сторонньої мікрофлори, що дуже важливо при роботі з культурами, виділеними з випорожнень.
Приклад. Нативний матеріал для посіву забирають з порції випорожнень конкретної людини в стерильну баночку або пробірку. Не пізніше 2 годин з моменту відбору проби, після підготовки зразка шляхом ретельного розтирання в невеликій кількості стерильного фізіологічного розчину, проводять посів на щільну селективну середу МРС-4.
Зразки з посівом нативного матеріалу поміщають в термостат, де витримують при температурі 36 # x000B1; 1 # x000B0; С протягом 2-3 діб в атмосфері вуглекислого газу.
Вивчають морфологічні і тинкторіальних властивості виділеної культури, для чого її зразки фарбують по Граму.
Ставлення мікробів до фарбування за Грамом є важливим диференціальним ознакою.
Ізолюють колонію лактобактерій за допомогою бактеріологічної петлі, роблять повторний пасаж і вирощування біомаси лактобактерій протягом 1-3 діб в умовах вуглекислого газу при температура 36 # x000B1; 1 # x000B0; С, пасаж і вирощування отриманого чистого культури лактобактерій в селективної рідкому середовищі МРС- 1, після чого вносять консервант в співвідношенні 1: 1 з розрахунку одна частина селітівной рідкої живильного середовища МРС-1 зі збільшеним чистої культурою і одна частина консерванту. Ретельно перемішують. Як консервант використовують сахарозо-желатинову середу.
Проводять контроль кожного зразка вирощеної біомаси на відсутність сторонньої мікрофлори і кількість життєздатних лактобактерій.
Для визначення чистоти культури (осутствіе сторонньої мікрофлори) відбирають 1 мл біомаси і проводять посів на щільні поживні середовища: живильний агар з 9% натрію хлориду, середу Сабуро, середовище Ендо. Посіви поміщають в термостат і вирощують 24-72 години, після інкубації посіви переглядають. Сторонньої мікрофлори не повинно бути.
Для визначення кількості життєздатних лактобактерій в 1 мл біомаси готують ряд десятикратних розведень.
З пробірки з розведення 10 -5 відбирають 1 мл вмісту, проводять посів на щільне середовище МРС-4 і поміщають в термостат при температурі 36 # x000B1; 1 # x000B0; С на 44-48 годин в атмосферу вуглекислого газу.
Після закінчення часу інкубації проводять підрахунок колоній, що виросли. Кількість життєздатних лактобактерій в 1 мл біомаси визначають за формулою
де А - кількість життєздатних лактобактерій в 1 мл біомаси;
В - число колоній, що виросли на щільному середовищі МРС-4;
n - номер останньої пробірки десятикратних розведень.
Біомаса повинна містити кількість життєздатних лактобактерій не менше 10 6 КУО в 1 мл біомаси.
У зв'язку з тим, що за пропонованим способом отримують рідку біомасу з клітин лактобактерій зі спорідненою антигенною структурою клітин кишечника споживача, вона може успішно застосовуватися для відновлення порушень мікробіоценозу кишечника і підтримки його в здоровому стані як при дисбактеріозах, так і з профілактичною метою.
Особливо важливим є використання запропонованого способу для нормалізації мікробіоценозу у вагітних жінок з метою профілактики дисбактеріозу у новонароджених і дітей 1-го року життя.
Спосіб отримання біомаси аутоштамма лактобактерій рідкої, який передбачає відбір проби нативного матеріалу, посів на селективну живильне середовище, вирощування лактобактерій, виділення лактобактерій, їх контроль, проведення повторного пасажу, вирощування отриманої культури лактобактерій в селективної живильному середовищі з наступним додаванням консерванту і контролем отриманої біомаси лактобактерій, відрізняється тим, що початковий посів в селективну живильне середовище виробляють без розведення нативного матеріалу, що не пізніше 2 годин з моменту взяття проби, до біомаси лактобактерій додають консервант, в якості якого використовують сахарозожелатіновую середу, в співвідношенні 1: 1 відповідно.