ТЕХНОЛОГІЯ ОТРИМАННЯ посівних КУЛЬТУР лактобактерій
І.В. ТИХОНОВ, Ю.С. ОВСЯННИКОВ, В.Г. КОМОСКО, С.А. ШВЕЦОВ, В.Є. РОМАНОВ
ФГТУ ВПО «Московська державна академія ветеринарної медицини та біотехнології імені К.І. Скрябіна »
В останні роки в Російській Федерації спостерігається різке погіршення епідемічної та епізоотичної ситуації. Відзначено підвищення питомої ваги дисбактериозов, причиною яких є погіршення екологічної обстановки, неконтрольоване використання в ветеринарії антибіотиків і різних хіміопрепаратів, гормонів і т.п. а також стресові фактори і умови, зниження якості питної води та кормів.
Вважається безперечним, що дисбактеріози у сільськогосподарських тварин і птахів набувають широкого поширення, так як при відсутності своєчасної корекції порушень нормомікрофлори вельми висока ймовірність розвитку у них важких, рецидивуючих інфекційних захворювань, імунодефіцитів, різних аллергопатіі, анемій, гастроентерологічних та інших хвороб, включаючи відставання в приростах , зниження ефективності виробництва.
В значній мірі нелікованих дисбактеріози небезпечні як для молодняку, так і репропродуктівного поголів'я сільськогосподарських тварин і птахів. Зростання інфекційної захворюваності бактеріальної, вірусної та іншої етіології багато в чому зумовлений зниженням рівня неспецифічної резистентності ™ організму тварин і птахів через виражених дисбіотичних порушень.
У зв'язку з вищевикладеним профілактика і лікування інфекційних захворювань і дисбактеріозів сільськогосподарських тварин і птахів в даний час і на найближчу перспективу є пріоритетними завданнями ветеринарії. Їх вирішення можливе за умови реалізації комплексу відповідних протиепізоотичних заходів, включаючи розробку, серійне виробництво і впровадження в практику нових лікувально-профілактичних засобів для попередження і терапії інфекційних захворювань і дисбактеріозів, що відповідають сучасному світовому рівню. При цьому важливе значення для забезпечення дієвості системи цих заходів має адекватність і єдина методологія використання відповідних лікувально-профілактичних препаратів. Такі в свою чергу обумовлюють необхідність підготовки, затвердження і доведення до широкого кола фахівців ветеринарної медицини інформаційно-методичних та довідкових документів з вищеназваних проблем.
При цьому очевидна необхідність поглиблення робіт з проблеми пробіотиків в аспекті пошуку нових штамів мікроорганізмів з пробіотичним дією, вдосконалення наявних і створення нових препаратів даного виду для підвищення їх ефективності.
З огляду на незначного числа публікацій про еубіотіческого дії лактобактерій у вітчизняній літературі актуальними є дослідження механізмів їх антагоністичної дії і умов збереження, підтримки і посилення корисних властивостей. Отримані результати можуть бути основою для розробки сучасних високоефективних пробіотиків на основі лактобактерій для ветеринарних цілей.
В процесі проведення науково-дослідних робіт в цьому напрямку потрібно виявити штами лактобактерій, які проявляють максимальну здатність пригнічувати розвиток ентеро, піогенними і коліпатогенних мікроорганізмів, досліджувати механізм їх антагоністичної дії, умови підтримки і збереження штамів. Визначити оптимальне співвідношення відібраних штамів в препараті, розробити спосіб приготування препарату, що забезпечує йому необхідні експлуатаційні характеристики і провести його випробування на сільськогосподарських тварин і птиці.
Аналіз даних літератури в області вибору мікро-організмів і розробки технології отримання препаратів з пробіотичним дією і їх використання дозволив визначити основні напрямки досліджень:
- пошук і оцінка біологічних властивостей нових штамів мікроорганізмів з пробіотичним дією;
- розробка на їх основі асоційованих культур;
- розробка методів приготування і підтримки еталонних і посівних робочих культур штамів мікроорганізмів з пробіотичним дією;
- розробка рідкої живильного середовища, що забезпечує інтенсивне накопичення біомаси лактобактерій в процесі періодичного динамічного гомогенного глибинного культивування;
- вивчення закономірності росту бактеріальної популяції в аеробних і анаеробних умовах;
- вибір оптимальних параметрів глибинного культивування мікроорганізмів з пробіотичним дією з метою збереження їх біологічно корисних властивостей;
- розробка готової форми препарату з пробіотичним дією на основі штамів лактобактерій, можливо, в комбінації з іншими бактеріями;
- оцінка відтворюваності технології приготування препарату з пробіотичним дією;
- вивчення специфічної безпеки і токсичності препарату на лабораторних тварин;
- перевірка ефективності використання розробленої асоціації пробіотика в практичному тваринництві та птахівництві.
Матеріали і методи дослідження. У роботі використовували штами мікроорганізмів роду лактобацил (Lactobacillus plantarum №3 і Lactobacillus buchneri №4) з колекції культур НДІ Мікробіології МО РФ.
Для вирощування штамів лактобактерій з метою оцінки їх біологічних властивостей готували живильні середовища на основі середовищ МРС-1 і МРС-4 відповідно до методики, викладеної в ФС на "Лактобактерин сухий".
Посівну робочу культуру лактобактерій отримували шляхом ряду пересівань сухий еталонної культури на стандартні поживні середовища МРС. На останній стадії була приготовлена агарових культур зі змивом її кріопротектор з подальшим заморожуванням і зберіганням при температурі мінус 20 ° С.
Культивування лактобактерій здійснювали в 20-літрових бутлях з рідким живильним середовищем МРС-1. Культури Lplantarum і L.buchneri в бутлях вирощували методом глибинного періодичного культивування з перемішуванням без аерації при температурі (37 ± 1) ° С протягом 48 і 72 годин.
Контроль середовищ здійснювали за фізико-хімічними та біологічними показниками.
Результати дослідження. Для приготування посівних робочих культур штамів лактобактерій використовували свежепересеянную еталонну культуру штамів лактобактерій на поживних середовищах МРС. Для цього бактеріальної петлею відбирали ізольовані колонії з щільного поживного середовища МРС, суспендованих в фізіологічному розчині і пересівали в рідку живильне середовище МРС у флаконі. Посіви інкубували при температурі 36. 38 ° С протягом 48 годин. Бульйонні культури потім пересівали на матрац зі скошеною щільним ПС МРС з розрахунку 5,0 мл культури на один матрац. Посіви в матрацах інкубували при температурі 36. 38 ° С протягом 48 годин для штаму L.plantarum 3 і 72 годин для штаму L.buchneri 4. Після закінчення терміну інкубації агарове культуру використовували для приготування посівної робочої культури. Для цього сформувався на ППС мікробний газон змивали 10,0 мл 1,5% -ного розчину поліглюкіну.
З огляду на високу біохімічну активність штамів лактобактерій, традиційна пропис захисного середовища при заморожуванні (сахарозо-желатинова) не могла бути нами використана. У зв'язку з цим був застосований нейтральний і досить вивчений кріопротектор полиглюкин.
Приготовану мікробну суспензію з поліглюкін розливали по 5 мл в пробірки і поміщали на зберігання при температурі мінус 20 ° С.
Результати оцінки виживаності штамів лактобактерій в складі свіжоприготовлених і зберігалися посівних робочих культур представлені в табл. 1.
Аналіз даних, представлених в табл. 1, свідчать про те, що мікробні культури штамів лактобактерій в складі обраного нами кріопротектори мають досить високу стійкість до заморожування та зберігання при температурі мінус 20 ° С. Найбільша кількість живих мікробів нами зафіксовано до б місяців зберігання культур в замороженому стані. В подальшій роботі нами використовувалися посівні робочі культури, які зберігалися при температурі мінус 20 ° С не більше б місяців.
Характеристики свіжоприготовлених і зберігалися при температурі мінус 20 ° С посівних робочих культур штамів лактобактерій (X ± Ig5, n = 5)
Виходячи з особливостей і способу застосування препарату пробиотического дії в ветеринарії, необхідна технологія отримання готової форми препарату, яка дозволяла б зберігати не менше одного року високу антагоністичну активність і кислотообразующую здатність, бути нешкідливою, зручною при використанні. Результати випробування штамів лактобактерій в промисловому птахівництві, отримані в ході виконання досліджень, дозволили встановити, що мінімальна концентрація живих клітин лактобактерій в готовій формі препарату повинна становити не менше ЗхЮ9 в мл.
Для отримання лікувально-профілактичного препарату із заданою концентрацією технологія повинна включати ряд послідовних стадій для накопичення достатньої біомаси лактобактерій. Технологічний процес накопичення біомаси з посівних робочих культур в наших дослідженнях складався з наступних стадій:
- отримання посівних культур I пересіву;
- отримання посівних культур II пересіву.
Дані, представлені в табл. 1, свідчать, що мікроби штамів лактобактерій в складі стабілізованих заморожених культур мають досить високою виживаність і можуть забезпечити необхідну концентрацію для отримання посівних культур I пересіву.
Для отримання культур I пересіву посівні робочі культури лактобактерій після розморожування з пробірок пересівали на скошену щільну живильне середовище МРС-4 в матрацах. Посіви інкубували при температурі (37 + 1) ° С протягом 48 год. Концентрацію лактобактерій в посівної культурі визначали шляхом підрахунку клітин в камері Горяєва.
Результати визначення концентрації лактобактерій в посівних культурах I пересіву представлені в табл. 2.
Таблиця 2
Концентрація клітин в посівних культурах лактобактерій I пересіву в матрацах зі скошеною агаризованому середовищем