Способи культивування вірусів. культури клітин
Паразитуючи на генетичному рівні як молекули НК, віруси, позбавлені енергообміну систем, не можуть, подібно бактеріям, розмножуватися на штучних поживних середовищах. Процес їх відтворення (репродукції) цілком обумовлений метаболізмом обмеженого кола чутливих організмів і клітин, які в вірусології називають господарями.
Вирощують віруси в культурах клітин або тканин, 7-13-денних курячих ембріонах і організмі лабораторних тварин, серед яких найчастіше використовуються білі миші, переважно 1-4-денні сисунці, кролики, сирійські хом'яки і африканські тхори.
Культура клітин - це вирощені in vitro (поза організмом) на спеціальних середовищах клітини різних тканин тварин і людини, в тому числі лейкоцити, що зберігають властиві їм обмін і сприйнятливість до певних вірусів. Головна вимога при роботі з культурами клітин і вірусами - суворе дотримання стерильності, яке досягається в асептичних умовах вірусологічного боксу.
Для вирощування клітин (тканин) застосовують різні поживні середовища (199 або Голка), що містять повний набір необхідних їм речовин (амінокислоти, пуринів, піримідинів, вуглеводи, вітаміни та ін.) З додаванням бичачої сироватки.
Є багато типів культур клітин: 1) первинні культури, здатні до 5-10-кратному пассірованія; 2) необмежено перещеплюваних; 3) полуперевіваемие, що представляють собою морфологічно однорідні клітини легенів і нирок людини, що зберігають в 50 пасажах диплоїдний набір хромосом.
Всі ці типи клітин вирощують при температурі 36-37 ° С в ультратермостат, отримуючи протягом 5-7 діб хороший моношар у вигляді пласта, зчепленого зі стінками матраців, флаконів і пробірок. Контролюють ріст клітин під малим збільшенням мікроскопа, починаючи з 3-4 дня.
Первинні культури клітин. Джерелом отримання первинних культур клітин є що володіють великою потенцією росту ембріональні тканини птахів (головним чином курячі фібробласти), експериментальних тварин, мавп, але частіше за все готують їх з трипсінізірована тканин абортованих 8-14-тижневих плодів людини. Для цього тканину плоду подрібнюють ножицями на дрібні шматочки розміром 2-4 мм і 2-3 рази відмивають від крові буферним розчином Хенкса, поки рідина не стане майже прозорою.
Потім для руйнування міжклітинної речовини шматочки тканини заливають підігрітим до 32-37 ° С 0,25% -м розчином трипсину, і в змішувачі на електромагнітної мешалке перемішують суспензію протягом 10-30 хв. Першу порцію трипсінізірована клітин видаляють. Відповідні для культивування вірусів клітини отримують після повторних тріпсінізаціі. Далі містить клітини рідина для відділення великих грудочок тканини і сполучнотканинних волокон фільтрують через марлю, центрифугують при 800-1000 об / хв протягом 5 хв. Надосадову рідину зливають, осад відмивають розчином Хенкса і розводять середовищем 199 (або Голка), щоб отримати в 1 мл 100 000-400 000 клітин. Суспензія клітин розливають по 1 мл в пробірки або по 20-100 мл в скляні матраци, щільно закривають гумовими пробками і поміщають в термостат при температурі 37 ° С. Матраци розташовують в горизонтальному положенні, а пробірки -під кутом 5-10 ° в спеціальних лотках. Прикріплений до склу, клітини протягом декількох діб утворюють моношар.
Перещеплюваних культури клітин. Це стабільні або, як їх нерідко називають, імморталізованних (безсмертні) лінії клітин, автономно розмножуються, подібно бактеріям. Отримують їх з нормальних тканин людини (амніону - FL, А-0, А-1; нирок - Rh, 1ШЧ, диплоїдних клітин); тварин (нирок мавп - Vero, MS, BSC-1; нирок кролика - ПК та його рогівки -SIRK) і злоякісних пухлин (шийки матки-HeLa, гортані - нер-2, порожнини рота - KB, кісткового мозку людини - Д-6 і ін.), які вирощуються шляхом послідовних пасажів на поживних середовищах ось уже багато десятків років.