Експрес-метод визначення стандартним універсальним реагентом в пробірці без підігріву
Для дослідження можна використовувати свіжу несвернувшейся кров, узяту з пальця (або вени) безпосередньо перед дослідженням, або консервовану кров без попередньої обробки, а також еритроцити з пробірки після формування згустку і відстоювання сироватки.
Методика проведення реакції. Дослідження проводять в центрифужних пробірках об'ємом не менше 10 мл. На дно пробірки вносять одну краплю стандартного універсального реагенту, що представляє собою антирезусну сироватку групи АВ (IV), розведену 33% розчином декстрану. Потім в неї додають одну краплю досліджуваної крові (або еритроцитів). Круговим обертанням пробірки вміст розмазують по її внутрішньої поверхні таким чином, щоб вміст розтеклося по стінках. Це значно прискорює агглютинацию і робить її крупнолепестковой. Аглютинація на стінках пробірки настає, як правило, протягом першої хвилини, але для утворення стійкого комплексу антиген-антитіло і чіткої аглютинації спостерігати слід не менше 3 хв. Потім для виключення неспецифічної агрегації еритроцитів в пробірку додають 2-3 мл фізіологічного розчину і перемішують шляхом одно-дворазового перевертання пробірки (без збовтування!).
Трактування результатів. Наявність аглютинації (великі пластівці на тлі просвітленої рідини) вказує на резус-позитивну приналежність досліджуваної крові. Відсутність аглютинації (в пробірці гомогенно пофарбована рожева рідина) свідчить про резус-негативної приналежності досліджуваної крові.
Лабораторні способи визначення резус-фактора
Для визначення резус-приналежності крові хворого в умовах лабораторії застосовують чотири основні методи.
Метод аглютинації в сольовому середовищі
Використовують спеціальні сироватки, що містять повні антитіла анти-резус. Еритроцити у вигляді 2% суспензії у фізіологічному ра- створі хлориду натрію з'єднують в пробірках з антирезусної сироваткою. Пробірки поміщають на 1 год в термостат при температурі 37 ° С, після чого осад еритроцитів на дні пробірки розглядають за допомогою лупи і по його формі враховують результат. При позитивному результаті (Rh +) осад має характерний малюнок у вигляді ниток або зернистості. При негативному (Rh-) осад розміщується рівномірним шаром і має вигляд правильно окресленого кола.
Метод аглютинації в присутності желатину
B дві пробірки поміщають по 0,02-0,03 мл осаду досліджуваних еритроцитів. Потім в першу пробірку додають 2 краплі (0,1 мл) 10% розчину желатину і 2 краплі (0,1 мл) анти-резусную сироватки, в другу (контрольну) пробірку - 2 краплі (0,1 мл) 10% розчину желатину і 2 краплі (0,1 мл) фізіологічного розчину.
Вміст обережно перемішують. Потім пробірки інкубують в термостаті при температурі 45-48 ° С протягом 30 хв, після чого додають 5-8 мл фізіологічного розчину і перевертають пробірки 1-2 рази для перемішування.
Результат враховують, переглядаючи пробірки на світло невоору- жённим оком або через лупу. Eсли еритроцити резус-положи- тельно, відбудеться їх аглютинація. Відсутність аглютинації свідчить про те, що випробувана кров резус-негативна. B контрольній пробірці аглютинація еритроцитів повинна бути відсутнім.
Непрямий антіглобуліновиі тест (реакція Кумбса)
Ця реакція найбільш чутлива для виявлення неповних антитіл до ауто- і ізоантігенамі еритроцитів. До неї, як правило, вдаються при виникненні труднощів у визначенні резус-при- надлежности крові, пов'язаних з нечіткими результатами, отриманими при інших методах дослідження. Реакція заснована на використанні антіглобуліновой сироватки.
При обробці резус-позитивних еритроцитів неповними антитілами анти-Rh наступає їх обволікання, сенсибілізація по відношенню до антіглобуліновой сироватці, яка агглютинирует сенсибілізовані еритроцити, оскільки має антитіла до глобулінів.
В пробірку вносять антирезусну сироватку і відмиті фізіологічним розчином еритроцити, поміщають на 1 год в термостат при температурі 37 ° С, після чого еритроцити ретельно відмивають. Наступний етап реакції проводять на площині. Краплю суспензії еритроцитів змішують з рівною кількістю антіглобуліновой сироватки і враховують результат. Наявність аглютинації - показник того, що досліджуваний зразок крові резус-позитивний. Якщо аглютинація відсутня, то випробувана кров резус-негативна.
Реакція з анти-D-моноклональними антитілами
На планшеті змішують велику краплю (0,1 мл) анти-D-моноклональних антитіл і маленьку краплю (0,01 мл) досліджуваної крові.
За реакцією спостерігають протягом 3 хв. При змішуванні анти- D-MKA із зразками резус-позитивних еритроцитів відзначають швидко наступаючу пелюсткову агглютинацию. Якщо кров резусотріцательная, аглютинація відсутня.
48. Проба на сумісність по резус - фактору.
Оснащення: кров донора, сироватка реципієнта, 33% розчин поліглюкіну, центріфужная пробірка, фізіологічний розчин натрію хлориду, піпетки.
а) З вени реципієнта взяти 3-5 мл крові, центрифугувати.
б) На дно центрифужной пробірки різними піпетками нанести 2 краплі сироватки хворого, 1 краплю донорської крові та 1 краплю 33% розчину поліглюкіну.
в) Вміст перемішати, нахиливши пробірку майже до горизонтального положення і повільно обертати навколо осі, розподіливши вміст по стінках рівним шаром.
г) Процедуру продовжувати протягом 5 хвилин.
д) Через 5 хвилин додати 3-4 мл фізіологічного розчину хлориду натрію.
е) Вміст перемішувати, 2-3 рази нахиляючи пробірку до горизонтальної площини (не збовтувати!).
Відсутність аглютинації, рівномірне фарбування вмісту пробірки свідчать про резус-сумісності крові донора і реципієнта; наявність аглютинації - про несумісність крові донора і реципієнта по резус-фактору
Після проведення першої проби необхідно провести пробу на сумісність по Rh-фактору. Для цього існує 2 доступних методу - реакція в сироваткової середовищі і в желатині.
Перший метод: на чашку Петрі наносять 1-2 краплі сироватки хворого і маленьку краплю донорської крові, після чого її на 10 хвилин ставлять у водяну баню (+46
+48 ° С). Наявність аглютинації свідчить про несумісність.
Другий метод: на дно пробірки поміщають маленьку краплю донорської крові, додають 2 краплі підігрітого 10% розчину желатину і 2 краплі сироватки крові хворого. Через 10 хвилин інкубування в водяній бані при. температурі + 46- + 48 ° С в пробірку додають 5 мл підігрітого ізотонічного розчину хлориду натрію. 'Наявність аглютинації свідчить про несумісність крові донора і реципієнта.
Слід зазначити, що ізоімунні антитіла і антитіла інших систем виявляються тими ж методами, що і антитіла анти-Rh, а деякі - як антитіла системи АВО. Тому несумісність крові донора за цими антитіл може бути виявлена при виконанні зазначених проб на сумісність.