При зберіганні антитіл при температурі нижче нуля, важливо не використовувати безморозільние холодильники. Звичайні побутові холодильники є безморозільнимі, і вони проходять цикли вільного відтавання кілька разів для запобігання утворенню інею.
Кон'юговані антитіла слід зберігати в темного кольору флаконах або у флаконах покритих алюмінієвою фольгою.
Хімічні модифікації, такі як окислення і протеолітична деградація білків відбуваються при помірній температурі, проте ступінь цих реакцій є набагато більш вираженою при високій температурі. Антитіла, як правило, зберігаються при ≤ 4 ° C в чистій і стерильною скляному посуді або поліпропіленових флаконах. Зберігання при кімнатній температурі часто призводить до деградації антитіл і / або інактивації, зазвичай в результаті зростання мікроорганізмів. Для короткого терміну зберігання (від 1 дня до декількох тижнів), розчини антитіл можна зберігати при температурі 4 ° C без значної втрати активності.
Кріопротектори: гліцерин і етиленгліколь
Утворення кристалів льоду може зруйнувати структуру білка, і таким чином, викликати втрату ефективності антитіл. Кріопротектори, такі як гліцерин і етиленгліколь, здатні запобігти утворенню водневих зв'язків між молекулами води і тим самим зменшити замерзання при додаванні до водного розчину. Фактична температура замерзання залежить від складу / концентрації кріопротекторів, див. Таблицю 2.
Таблиця 2. Точки замерзання гліцерину і етиленгліколю (в градусах Цельсія) при різних концентраціях (у відсотках%) у воді.
Примітка: етиленгліколь є токсичним і повинен використовуватися з обережністю.
Якщо температура зберігання нижче точки замерзання для розчину антитіл з кріопротекторами, розчин буде укріпляти. Однак замість утворення кристалів льоду, може відбуватися вітрифікація, як в разі кріоконсервації клітин / ембріонів з ДМСО. В процесі вітрифікації стеклования, структурна цілісність антитіл зберігається.
Для підвищення стабільності, гліцерин або етиленгліколь додають до кінцевої концентрації 50% і антитіла можна зберігати при -20 ° C. Розчин антитіл слід зберігати в невеликих обсягах, щоб уникнути повторних циклів заморожування-розморожування.
Важливо використовувати стерильний гліцерин, так як гліцерин може бути забруднений мікробами.
Figure 1. Азид натрію при різних концентраціях інгібує ріст грамнегативних бактерій. З [2].
Стерилізація і антимікробні сполуки
Препарати антитіл завжди повинні бути стерилізовані фільтруванням з використанням 0,45-мікронного фільтра і повинні бути оброблені в асептичних умовах для запобігання мікробного забруднення.
Антимікробні агенти, такі як азид натрію (NaN3) в кінцевій концентрації 0,02-0,05% (вага / об'єм) або тімеросал в кінцевій концентрації 0,01% (вага / об'єм) інгібують мікробний зростання.
Азид натрію (NaN3) є токсичним для більшості клітин і організмів, включаючи людини (див. Малюнок 1) [1]. Проте, грампозитивні бактерії (стрептококи, пневмококи, лактобацили) стійкі до азиду натрію див. Малюнок 2) [2] [3] [4]. Азид натрію інгібує цитохром оксидазу в мітохондріальної ланцюга перенесення електронів і викликає, наприклад, апоптоз в RGC-5 клітинах [5]. Антитіла в розчині азида натрію не повинні бути використані безпосередньо в живих клітинах або в дослідженнях in vivo. Крім того, азид натрію перешкоджає більшості реакцій сполучення. Азид натрію може бути видалений за допомогою гель-фільтрації або діалізу.
Примітка: азид натрію був використаний в подушках безпеки автомобілів старшого покоління випуску.
Figure 2. Азид натрію не може пригнічувати ріст грам-позитивних бактерій. З [2].
Інгібітори протеази запобігають протеолітичну розщеплення білків. Протеолиз антитіл може стати важливим питанням для зберігання препаратів асцитної рідини і сироваток, так як і асцитної і сироваткові препарати містять протеази. Холодний спосіб зберігання і / або інгібітори протеази можуть бути використані для усунення цієї деградації.
Антитіла в розчинах (1 мг / мл) при зберіганні.
Несе білок або білок-наповнювач, такий як очищений бичачий сироватковий альбумін (БСА) або желатин, можуть бути додані для розведення антитіл до кінцевої концентрації білка 1-5 мг / мл (0,1-0,5%).
Сухий лід при зберіганні і транспортуванні
Недавні дослідження показує, що сухий лід під час зберігання і транспортування білка може викликати ацідіфікаціі розчину для зберігання, і буде викликати агрегацію білків (з утворенням осаду), особливо з ацидності білками (білки з pI менше 7) [6]. Поліклональні IgG мають тенденцію бути ацидності, з pI в діапазоні 4.7-7.5 [7]. Закупорені газом флакони і / або запечатані газом пластикові мішки (для розфасовки флаконів) повинні бути використані для мінімізації пошкодження на додаток до повторно еквілібраціі зразків при -80 ° C в морозильнику протягом декількох днів. Пакети Dri-Shield Moisture Barrier Bags від 3М, продукція Thermo Scientific ™ Nunc ™ Cryoflex і пакети IMPAK, такі як 0203PM56OZETN і 05MP081OZE, можуть бути корисні.
Ефект окислення молекул антитіл був ретельно вивчений, особливо для терапевтичних антитіл. Залишки метіоніну в структурній ланцюга антитіла, як правило, є основним сайтом окислення, коли антитіла піддаються впливу інтенсивного світла і / або при підвищеній температурі [8]. Антитіла містять як внутрішньо- так і междуцепочечную дисульфідні зв'язки. Зазвичай використовуються антиоксиданти, такі як 2-МЕ і DTT, не можуть запобігти дисульфідні перегрупування [9]. в той час як інший антиоксидант - метіонін не сприяє розбудові дисульфідних груп і може бути кращим антиоксидантом для зберігання антитіл [Всі Fitchmun, Somatek, Сан-Дієго, Каліфорнія, США].
Активність майже не втрачається, якщо сироватку безпосередньо зберігати протягом десяти років при -20 ° C. Однак, після очищення антитіл, деяка втрата активності була помічена протягом багатьох років, хоча і дуже повільно. Представляється також, що гліцерин не є необхідним для зберігання при -20 ° C протягом багатьох років або навіть десятиліть, якщо антитіла не підлягають повторним циклів заморожування / розморожування. Антитіла слід зберігати у високій концентрації.
Моноклональні антитіла можна зберігати при -20 ° C в 50% гліцерині. Повідомляється також, що моноклональні антитіла можуть бути збережені під насиченим сульфатом амонію у вигляді гранул при 4 ° C або -20 ° C протягом багатьох років без втрати активності, бактеріального росту або окісленія.Ліофілізація (висушування виморожуванням або висушування із замороженого стану) забезпечує альтернативний спосіб стабілізації антитіл, які не стійкі до заморожування. У більшості випадків, ліофілізовані білки можна зберігати при -20 ° C. Ліофілізація вимагає дорогого устаткування і є трудомістким.
Антитіла слід зберігати в затемнених або покритих алюмінієвою фольгою контейнерах.
Лужна фосфатаза та інших кон'юговані ферменти особливо чутливі до заморожування, і в цілому їх слід зберігати при температурі 4 ° C після кон'югированія на короткий срок.Кон'югати антитіл найкраще зберігати протягом тривалого терміну при -20 ° C з гліцерином або етиленгліколь при кінцевій концентрації 50 %. Хоча деякі кон'югати ферментів можуть зберігатися при температурі -20 ° C без кріопротекторів, заморожені зразки повинні бути призначені для одиничного використання для запобігання повторюваних циклів заморожування-розморожування.
Флуоресцеін- кон'юговані антитіла
Флуоресценція може знижуватися при впливі світла. Як і будь-які реагенти кон'юговані з флуоресцентними мітками (а не лише антитіла), кон'югати антитіла повинні бути захищені від світла. Флуорофоркон'югірованние антитіла слід зберігати при температурі 4 ° C і ніколи не заморожівать.
Lichstein H, Soule M. Studies of the Effect of Sodium Azide on Microbic Growth and Respiration: I. The Action of Sodium Azide on Microbic Growth. J Bacteriol. 1944; 47: 221-30 PMID 16560767
Lichstein H, Soule M. Studies of the Effect of Sodium Azide on Microbic Growth and Respiration: II. The Action of Sodium Azide on Bacterial Catalase. J Bacteriol. 1944; 47: 231-8 PMID 16560768
Lichstein H. Studies of the Effect of Sodium Azide on Microbic Growth and Respiration: III. The Effect of Sodium Azide on the Gas Metabolism of B. subtilis and P. aeruginosa and the Influence of Pyocyanine on the Gas Exchange of a Pyocyanine-Free Strain of P. aerugino. J Bacteriol. 1944; 47: 239-51 PMID 16560769