Багата живильне середовище - прекрасний субстрат для розвитку в ній мікроорганізмів. Для знезараження поживних середовищ використовують хімічний вплив (дезінфекція), вплив температури та інших фізичних факторів (ультразвук, ультрафіолетові промені, ультрафільтрація). Кожен з цих методів дуже вибірковий для застосування.
У біотехнології широко використовують термічні методи знезараження (автоклавирование, стерилізацію, кип'ятіння, пастеризацію і ін.)
Як відомо, окремі компоненти поживних середовищ також по-різному реагують на термічний вплив. Особливо термолабільни органічні сполуки: вітаміни, вуглеводи, гормони та ін. Складні цукру і полісахариди при автоклавуванні частково гідролізуються. Ступінь гідролізу залежить від джерела вуглецю, температури і тривалості автоклавування. При високих температурах відбувається карамелизация цукрів.
Розчини, що містять амінокислоти і відновлюють цукру, при термічному впливі набувають коричневий колір внаслідок сахароамінних реакцій.
Щоб уникнути небажаних деструктивних змін компонентів поживних середовищ (субстратів) застосовують по можливості більш м'які режими стерилізації (табл. 4.4) або роздільну стерилізацію компонентів. Високі, але короткочасні температурні режими інактивують спори бактерій, надаючи мінімальний вплив на біологічно активні компоненти середовища. У лабораторних умовах стерилізацію живильних середовищ і деяких інших об'єктів проводять в автоклавах паром під тиском, дотримуючись необхідні режими. В окремих випадках вдаються до сухожарової стерилізації.
Таблиця 4.4. Режими стерилізації поживних середовищ
Встановлено, проте, що температура вище 121 С може бути причиною порушення якості середовищ і, як наслідок, поганого росту культур. До того ж в принципі бажана стерилізація в автоклаві невеликих обсягів поживних середовищ, що за інших рівних умов дозволяє зменшувати час стерилізації, так як коротшає період прогріву проб (табл. 4.5).
В останнє десятиліття широке поширення для отримання стерильних повітря і різних рідин придбала мембранна фільтрація. Це різновид холодної стерилізації, яка ефективна для стерилізації термолабільних речовин.
Промисловий випуск мембранних фільтрів було розпочато з кінця 40-х рр. минулого століття. Згідно Р.Е. Кестінгу (1971), найбільш поширеними процесами є звичайна фільтрація (макрофільтрація -1-10 мкм), мікрофільтрація (20 -10 мкм), ультрафільтрація, діаліз (10 мкм-1 нм).
Якщо для макрофільтраціі застосовуються звичайні паперові або скляні фільтри, то для інших використовуються нітроцелюлозні, ацетілцеллюлозние, полівінільние, поліамідні, фторуглеродниє мембрани товщиною менше 0,1 мкм з високим ступенем пористості і з діаметром пір в межах 10-4-10 мкм. Для стерилізації в біотехнологічних цілях досить мікрофільтрації.
Основні вимоги до умов культивування
Всі маніпуляції з культурою ізольованих тканин рослин проводяться в стерильних умовах. Комплекс заходів, що забезпечують асептики біотехнологічних процесів, включає механічну, фізичну і хімічну захист біооб'єкту і середовища її проживання, а при необхідності - і кінцевого продукту.
Асептика передбачає вологе прибирання приміщень, обробку їх ультрафіолетовими променями, антисептичними засобами, використання стерильних інструментів, середовищ, технологічного одягу, подачу стерильного повітря (столи з ламінарним потоком стерильного повітря в боксованих приміщеннях, надходження в ферментатор стерильного повітря через барботер - від франц. Barbotage - перемішування) та ін.
До механічної захисту відносяться видалення механічних домішок, наприклад, з повітря, культиваторів; герметизація обладнання, ізоляція вузлів і з'єднань; до фізичної - обробка повітря і поверхонь приладів і апаратів ультрафіолетовими променями, кип'ятіння, стерилізація парою під тиском, обробка ультразвуком; до хімічної - обробка робочих поверхонь і біооб'єктів хімічними антисептиками.
У виробничих умовах джерелами мікробів-контамінантів можуть бути грунт, вода, навколишнє повітря, люди. З грунту в сферу біотехнологічних процесів потрапляють спороутворюючі палички-бацили, конідії грибів, актиноміцети; ці ж мікроорганізми з пилом можуть потрапити в повітря, з якого вони здатні проникнути в середу вирощування біооб'єкту або в кінцевий продукт виробництва
Культивування ізольованих тканин рослин відбувається на світлі. Освітленість факторостатной (світловий) кімнати повинна складати залежно від культури 1 000-10 000 лк. Необхідно враховувати фотопериод, який потрібно для даного культивованого об'єкта.
Вологість в світловий кімнаті повинна бути 60-70%. Більш сухе повітря сприяє усихання живильного середовища в пробірках і колбах, особливо якщо вони закриті ватяними пробками, зміни її концентрації, а значить, і порушення умов культивування. Для підвищення вологості в кімнаті можна використовувати піддони з водою.
Оптимальна температура для більшості культивованих тканин -25-26 ° С, для культури тканин тропічних рослин - 29-30 ° С. У разі індукції морфогенезу температуру знижують до 18-20 ° С.
Для успішного культивування ізольованих клітин і тканин рослин необхідно дотримуватися певних умов. Більшість калусних тканин не потребує світлі, так як не має хлоропластів і харчується гетеротрофно.
Виняток становлять деякі зелені калусних тканини, такі, наприклад, як тканину мандрагори. Калусних тканини отримують в темряві або при розсіяному світлі, а для успішного морфогенезу їх переносять в приміщення з інтенсивним освітленням 1 000-4 000 лк.
Світловий і температурний режими, як і інші умови, залежать від виконуваних завдань. Найкращі їх параметри, а також режим оптимальної вологості можна створити за допомогою кліматичних камер.
Н.А. Воїнів, Т.Г. Волова