Після розведення кілька крапель зразка досліджують сперму під мікроскопом, а розведену сперму зливають в пластикові центрифужні пробірки, які поміщають в посудину з водою, підігрітою до 35С. Потім посудину переносять в холодильник і залишають на 2 години при температурі 4С. За цей час сперма охолоджується до 4-5 С, а гліцерин, який виконує роль захисного фактора, проникає в мембрану сперматозоїдів.
Сперму виймають з холодильника, осторож-но збовтують і негайно поміщають в пла-стіковие соломини (пайеттах) ємністю 0,5 мл. Для виконання процедури застосовують спеці-ний відсмоктування або насмоктують ротом через латексну трубку. При розподілі сперми слід простежити за тим щоб порошок, що знаходиться між кінцями фільтрів соломини, просочився рідиною і затвердів. Спочатку соломини запол-ють наполовину, після чого, залишаючи бульбашка повітря, доливають, не доводячи 1 см до верху. Пузи-річок повітря перешкоджає переливанню сперми (за рахунок зміни тиску при розморожуючись-ванні). Після цього соломину запечатують.
Існують два альтернативних методу заморозити-ки - ручна і автоматична. Частка глиця-рина в складі розчинника залежить від застосо- емого методу. При ручному заморожування використовують контейнер (30 х 40 х 30 см) з полістиролу зі знімною металевої полицею, помешения на 10 см нижче краю. Контейнер заповнюють жид-ким азотом до рівня, що знаходиться на 4 см нижче полки.
Заповнені соломки (8-10 максимально) захоплюють пінцетом, поміщають горизонталь-но на полицю і залишають в випаровується азоті на 8 хвилин. Потім пінцет охолоджують в рідкому азоті, піднімають і повертають з його по-міццю пайеттах, одну за одною, щоб упевнитися в повній кристалізації їх вмісту. Після цього пайеттах занурюють в рідкий азот. Таку процедуру називають статичної в зв'язку з присутністю постійного нерегуліру-ного потоку випаровується азоту в період охолодження і заморозки.
Автоматична заморозка увазі ис-користування машини. Такий спосіб називають динамічним, оскільки випаровується азот надходить в морозильну камеру з різною швидкістю в залежності від заданої програм-ми, що дозволяє регулювати темпи заморозити-ки. Пайеттах заморожують в гори-зонтальним положенні на полиці з кришкою, причому в морозильній камері може перебувати кілька таких полиць. Програма заморозки включає наступні режими:
• -2 0 С / хв, починаючи з +4 0 С до -7 0 С
• -50 0 С / хв, від -7 0 С до -100 ° С
• -25 0 С / хв, від-100 0 С до-180 0 С.
після закінчення процедури полку поміщають безпосередньо в рідкий азот.
Пайеттах розморожують на водяній бані (в тер-Космос) при температурі 70 "С протягом 8 секунд. Після розморожування їх ставлять вертикально фільтром вниз, роздруковують кришку, встряхі-ють, щоб бульбашка повітря міг піднятися вгору. Соломку розкривають і кілька крапель зразка поміщають на підігріте предметне скло для оцінки параметрів сперми після розморожуючись-ня. до відновлення рухливості спермато-зоідов проходить деякий час, зазвичай 2 мі-нут буває достатньо. У зв'язку з тим, що різні лабораторії використовують різні техніки за-м оражіванія, при розморожуванні зразка спер-ми, отриманого з якоїсь певної ла-бораторіі, необхідно строго дотримувати всі по-лучанин звідти рекомендації, оскільки процеси заморожування і розморожування тес-но пов'язані між собою.
Штучне запліднення свіжою спермою. Практикується в випадках, якщо природна в'яз-ка неможлива з ряду причин: кобель і сука живуть досить далеко один від одного; заводчик намір запліднити декілька сук або побоюються-ся прямого контакту суки з виробником в зв'язку з поширеністю інфекційних захворювань.
Штучне осемененіезамороженной сперми
При наявності свіжої сперми процедуру осеме-вати проводять в день овуляції, а потім через2 дня повторюють. При використанні заморили-женной сперми, яка характеризується сни-женной життєздатністю, оскільки процес-си заморожування і розморожування оказива-ють негативний вплив на акросоми і мембрани сперматозоїдів, - запліднення осу-ються через 1 -2 дня після овуляції, і вто-рую процедуру проводять через 24 години після пер-виття. Проби прогестерону в сироватці крові служать хорошим індикатором овуляції. Кон-центрація прогестерону, що визначається радіо-імунним методом, повинна підтримуватися на рівні 30 нмоль / л (10 нг / мл) в перший день і між 55 і 75 нмоль / л (18-25 нг / мл) на другий день запліднення. Швидкий імуноферментний метод визначення також підходить для оцінки якісного і коллічественние содер-жания прогестерону.
Свіжу сперму вводять в піхву за допомогою жорсткого пластикового катетера, що застосовується для осіменіння корів, але укороченого до потрібного розміру. Катетер забезпечений шприцом на 2-5 мл з гумовим поршнем. (Рис. 6). Необхідно мати на увазі. що не всякий шприц можна використовувати, оскільки деякі типу гум надають токсичну дію на сперматозоїди.
Мал. 6 Три різні види катетерів з нейлонової напраияющей трубкою, використовуваних для трансцервікально внутріматочнаго штучного осіменіння собак. Внизу - звичайний пластиковий катетер для корів. укорочений до необхідної довжини для інтра- вагінального запліднення у собак.
Об'єм, що вводиться не повинен перевищувати 3 мл для великих порід і 2 мл для дрібних, в іншому випадку сперма може випливати з статевих шляхів самки. Вульву піднімають вказівним стіковий катетер. Після введення каудальной кінець каетера піднімають і ведуть уздовж дорсальній стінки піхви до склепіння піхви для того, щоб уникнути попадання катетера в сечовий міхур, оскільки отвір уретри розташовується на вентральній стінці піхви. Другою рукою оператор пальпує шийку матки через черевну стінку, коригуючи просування катетера. Сперму вводять повільно, після чого витримують самку протягом 10 хвилин нут в положенні з піднятим крупом. Поглинутої-ня області вульви викликає скорочення матки, що сприяють просуванню сперми.
Для запліднення свіжою і заморожене-оттаяной спермою розроблений спеціальний всередині матковий катетер (Рис.6), що складається з нейлонової направляючої і ме-металевого катетера з прикріпленим шпіцом. Техніка полягає у введенні в піхву направляючої трубки, з металевим катетером усередині; після того, як трубка торкнеться-ся зводу піхви, металевий катетер вид-Віган вперед і вводять в шийку матки, дотри-жива її великим і вказівним пальцем через стінку черевної порожнини (Рис.7).
Ріс.7.Іскусственное запліднення собаки за допомогою внутрішньоматкового катетера. Поверх катетера надіта мастикова трубка, що запобігає Контаміна-цію вагінальної мікрофлорою або травмуслізістойвлагаліща металевим катетерам.
Канал шей-ки прямий з незначними складками і по-шануй повністю розкритий на стадії еструса, поет-му введення катетера зазвичай не викликає затруд-нений. Для виконання процедури тварина піднімають на стіл, седація зазвичай не требуетса (Рис. 8).
Виконання маніпуляції припускає-лага наявність певних навичок, займає у досвідченого оператора не більше 1-2 хвилин і не заподіює тварині дискомфорту. Після ви-конання внутриматочного запліднення припод-розуміти тазову область суки необов'язково.
Незважаючи на можливість інтравагінального запліднення при використанні заморожене-відталої сперми найкращі результати забезпе-безпечує всередині маточне запліднення, позволя-ющее до того ж знизити дозу сперми.
Якщо катетеризація неможлива або опера-тор незнайомий з технікою її проведення, реко-мендується штучне запліднення в ході лапароскопії або із застосуванням ендоскопа. У США і Канаді хірургічні методи ис-кусственного запліднення є найбільш поширеними. Однак в більшості європейських країн інтравагінальне осеме-ня, а також техніки із застосуванням кате-тера і ендоскопа вважають більш етичними.
