Перед детальним вивченням процесу складання полинуклеотидной (тобто складається з безлічі нуклеотидів) ланцюга ДНК варто згадати, що представляє собою окремий нуклеотид. На схемі праворуч зображено цитозин, що складається з:
- азотистого підстави (в правій частині схеми, атоми азоту позначені синім кольором), що є кодує частиною нуклеотиду. Саме воно відрізняє один нуклеотид від іншого.
- цукру дезоксирибози. Атоми вуглецю, що утворюють дезоксирибози, пронумеровані.
- фосфатної групи (оранжево-червоною зліва).
Цукор і фосфат є некодуючими частинами нуклеотиду, їх функція полягає в створенні каркаса ДНК. Саме з ними працюють ДНК-полімерази, створюючи зв'язку між нуклеотидами.
У будь-якій клітині існує декілька видів ДНК-полімерази, що розрізняються за функціями на дві групи:
1. здатні здійснювати синтез великого фрагмента ДНК полімерази, які беруть участь в реплікації ДНК. Ці ж ферменти використовуються і в процесі репарації. або виправлення довгого пошкодженої ділянки ДНК, так як вони здатні заново створити частина відновлюваної ланцюга. Іноді цю групу ДНК-полімерази називають ДНК-реплікази. Надалі ДНК-полімерази без уточнень будуть називатися ісплючітельно ферменти цієї першої групи.
2. допоміжні ДНК-полімерази беруть участь в процесах реплікації і репарації «на других ролях». Деякі з них здатні відновлювати пошкодження ДНК розміром в декілька нуклеотидів, інші необхідні для усунення виникаючих при реплікації проблем. Наприклад, наткнувшись на пошкодження матричної ДНК, репликативная вилка зупиняється, і відновлює її рух одна з допоміжних ДНК-полімерази. А допоміжна ДНК-полімеразаα у еукаріот містить в собі праймаза, тому її завданням є створення затравки для подальшого синтезу ланцюга ДНК-полімеразою першої групи.
На схемі зліва зображено приєднання нуклеотиду, що знаходиться внизу картинки, до кінця вже існуючої ланцюга. При формуванні полінуклеотидних ланцюга кожен нуклеотид прикріплений до попереднього своєї фосфатної групою, підставляючи свою дезоксирибози для приєднання наступного. Тому з одного боку такий ланцюг закінчується стирчить дезоксирибозою, точніше навіть підвішеною до її третього за рахунком атому вуглецю гідроксильною групою (ОН). Саме тут буде приєднуватися наступний нуклеотид, тому такий закінчується вільної дезоксирибозою кінець називають 3'-кінцем ланцюга ДНК. Інший кінець молекули закінчується фосфатом останнього нуклеотиду, прикріпленим до п'ятого атому вуглецю дезоксирибози. Його позначають 5'-кінець.
Всі без винятку ДНК-полімерази не можуть працювати з 5'-кінцем ланцюга ДНК. Вони здатні приєднати новий нуклеотид тільки до 3'-кінця. Тому дочірня ланцюг завжди будується в напрямку від її 5'-кінця до 3'-кінця. ДНК-полімераза з'єднує атом фосфору з фосфатної групи нового «цеглинки» з атомом кисню з дезоксирибози останнього нуклеотиду в ланцюзі, відрізаючи «зайві» атоми водню і кисню, що утворюють в результаті молекулу води. Отриману зв'язок фосфатної групи з дезоксирибозою називають фосфодіефірних. Вона ж використовується і при побудові молекул РНК.
З глави 28 ти вже знаєш, що створення дочірніх ланцюгів на двох роз'єднаних матричних ланцюгах ДНК відбувається одночасно. І можливо ти звернула увагу на те, що зображується цей процес часто саме так, як на картинці внизу: одна з розплетених ланцюгів ДНК витягнута в лінію, а інша зігнута петлею.
По кожній з матричних ланцюгів ДНК-полімераза рухається від 3'-кінця (в цьому випадку його доречніше було б називати 3 '- «початок») до 5'-кінця, добудовуючи антипаралельну дочірню ланцюг, яка починається з 5'-кінця і поповнюється приєднуються з 3'-кінця нуклеотидами. Звідси зрозуміло, що тільки по одній з материнських ланцюгів ДНК-полімераза може проїхати від її 3 '- «початку» до 5'-кінця, приєднуючи нуклеотиди як тільки ХЕЛІКАЗИ від'єднує від них другий ланцюжок-матрицю.
З другої ланцюгом все виходить складніше: її не можна взяти за початок і будувати до кінця, тому що замість 3 '- «початку» там 5'-кінець. Напрямок реплікації по цьому ланцюзі протилежно напрямку її розплітання. Саме тому частина цієї відстає ланцюга починає будуватися тільки тоді, коли вже значну ділянку матричної ланцюга «оголений»:
=) Праймаза створює приманку біля ХЕЛІКАЗИ, але рухається не слідом за нею, а в зворотному напрямку. На схемі вгорі праймаза намальована як раз в цьому місці: вона вже встановила перший нуклеотид затравки і приєднала до нього другий з його 3'-кінця.
=) На приманку, або праймер, сідає ДНК-полімераза і добудовує дочірню ланцюг, поки не наткнеться на готову подвійну спіраль. Найчастіше ця спіраль є результатом попереднього проходження по відстає ланцюга ПРАЙМАЗИ і ДНК-полімерази, що побудували попередній ділянку дочірньої ланцюга. На схемі вгорі видно, як ця ДНК-полімераза надбудовує 3'-кінець фрагмента відстає ланцюга, який скоро дійде до праймера попереднього фрагмента. Відстає ланцюг будується з безлічі таких ділянок «праймер + ДНК», які називаються фрагментами Окадзакі. У бактерій фрагменти Окадзакі мають довжину близько тисячі нуклеотидів, а у еукаріот - всього лише близько ста.
=) Доходячи до праймера, утвореного із рибонуклеотидов, ДНК-полімераза ссавців витісняє його з материнської ланцюга, добудовуючи повноцінну ДНК. Зустрівши дезоксірібонуклеотідов, вона від'єднується від ДНК і перескакує на ближчий до ХЕЛІКАЗИ праймер, заповнюючи нуклеотидами проміжок між ним і щойно збудованим ділянкою дочірньої ланцюга. У прокаріотів будує фрагменти Окадзакі ДНК-полімераза не спроможна витіснити приманку і залишає ДНК, залишивши праймер на місці. З ним працює допоміжна ДНК-полімераза I прокариот, вміє вирізати рибонуклеотиди, одночасно замінюючи їх на дезоксирибонуклеотидів.
=) Витіснення затравки швидко зрізаються з ДНК ссавців іншими ферментами, після чого залишається щілину між кінцем одного фрагмента Окадзакі і початком іншого. Щілина являє собою не відсутність одного-двох нуклеотидів, а відсутність з'єднання один з одним фосфату і дезоксирибози сусідніх учасників ланцюга. Цю щілину «заклеює» ДНК-лігаза. роль якої не обмежується цим її участю в процесі реплікації. Ланцюги ДНК періодично пошкоджуються, в тому числі утворюються такі щілини між нуклеотидами, або ники. Тому ДНК-лігази часто «інспектують» ДНК клітини, виправляючи ушкодження. На схемі праворуч видно, що вони запускають таку ж хімічну реакцію, що і ДНК-полімерази при нарощуванні дочірньої ланцюга. При синтезі ДНК прокаріотів після заміни праймера на дезоксирибонуклеотидів утворюється така ж щілину між фрагментами Окадзакі. Її усуває прокаріотична ДНК-лігаза.
Таким чином, незважаючи на побудову лідируючої і відстає ланцюгів в протилежних напрямках, вони будуються одночасно. І вийшла в результаті з'єднання ДНК-лігази численних фрагментів Окадзакі, створених багаторазово сідають на материнську ланцюг ферментами відстає ланцюг нічим не відрізняється від лідируючої ланцюга, створення якої стало результатом більш простого процесу.
Після прочитання цієї і попередньої глави генетичної лінії ти вже знайома з деякими органеллами реплісоми:
=) ХЕЛІКАЗИ, розплітає матричну ланцюг
=) SSB-протеїни, які утримують розплетені ланцюга в готовому до реплікації стані
=) ПРАЙМАЗИ, початківці будувати дочірню ланцюг
=) ДНК-полімерази, що виконують основну роботу по створенню цього ланцюга
=) ДНК-лігаза, що з'єднує окремі ділянки побудованої ланцюга.
Ці органели можна назвати основними частинами реплісоми. Функції інших органел не менш важливі для успішної реплікації:
=) В реплісому входить фермент топоізомераза. здатний змінювати ступінь закрученности спіралі ДНК. Різні види топоізомераз необхідні і поза процесом реплікації для підтримки ниток ДНК в стабільному стані: якщо спіраль надмірно або недостатньо закручена, це легко може привести до її пошкодження. Один з видів топоізомераз є частиною реплісоми: він спеціалізується на підтримці нормального ступеня закрученности того ділянки ДНК, який передує розплітає ХЕЛІКАЗОЙ.
Щоб уявити, що відбувається при розплітання двох утворюють спіраль ниток ДНК, можна взяти мотузку, скручену з двох волокон (такі ми використовуємо для підв'язування гілок лимонних туй, що нависають над стежкою), і почати її розплітати, взявши по одному волокну в кожну руку і розтягнувши їх в сторони. Майже відразу ж складається з двох волокон частина мотузки почне крутитися, намагаючись компенсувати таким чином розплітання, і навіть в такому випадку в точці роз'єднання виникає «перекручений», що заважає подальшому розплітанню волокон. А якщо мотузка довга, то перекручений швидко досягне такого ступеня, що мотузка взагалі перестане розкручуватися. Посмикавши за кінці остаточно заплуталася мотузки, ти легко оціниш важливість роботи щодо запобігання перекручування ниток ДНК при реплікації. Топоізомераза еукаріот, що виконує цю функцію, називається ДНК-гіразу.
=) На кожній матричної ланцюга ДНК знаходиться затиск. здатний ковзати уздовж цього ланцюга, до якого прикріплюється ДНК-полімераза. Всього до складу реплісоми входять два затиску, по одному для кожної споруджуваної ланцюга.
=) Обидва затиску розкриває, накладає на ланцюг і защелкивает один клемп-Лоудер. прикріплений до розплітає нитки матричної ДНК ХЕЛІКАЗИ. На лідируючу ланцюг затиск накладається тільки один раз, а ось побудова відстає ланцюга вимагає постійної участі клемп-Лоудер: він приєднує затиск на початку кожного фрагмента Окадзакі (рисунок 1), знімає його коли фрагмент добудований (рисунок 3), і переносить до початку наступного фрагмента (рисунок 4).
Отже. підведемо підсумок обох описують відтворення ДНК глав підручника:
1. Всі ДНК-полімерази здатні створювати ланцюг ДНК тільки в одному напрямку, приєднуючи фосфатну групу нового нуклеотиду до 3'-кінця будується ланцюга. Так як комплементарні ланцюга, складові молекулу ДНК, протилежно спрямовані (5'-кінець однієї з'єднаний з 3'-кінцем інший ланцюга), то і синтез дочірніх ланцюгів по ним йде в протилежних напрямках. При цьому на розплітання ділянці по одній (лідируючої) ланцюга синтез йде безперервно, а на іншій (запізнілої) створюються окремі фрагменти Окадзакі, що будуються в напрямку, протилежному напрямку розплітання матричних ланцюгів, тобто «задом наперед». Зростаючим у фрагментів Окадзакі виявляється 3'-кінець, як і у лідируючій ланцюга.
2. новосинтезовані фрагменти ланцюга ДНК завжди містять на 5'-кінці кілька рибонуклеотидов. Цю РНК-затравки створює спеціальний фермент праймаза, який може бути окремою органел реплісоми (у прокаріот) або бути субодиницею допоміжної ДНК-полімерази (у тварин). Припускають, що використання ПРАЙМАЗИ пояснюється походженням апарату реплікації ДНК від РНК-полімерази, здатних синтезувати виключно РНК. Також існує функціональне пояснення існування праймерів: в момент ініціації синтезу більша ймовірність помилок, тому перші встановлені в ланцюг нуклеотиди бажано відрізняти від решти новосинтезованих ланцюга. Використання рибонуклеотидов дозволяє безпомилково розпізнавати затравки, видаляючи їх згодом і накладаючи латочку з дезоксирибонуклеотидов на розрив, що утворився в ланцюзі ДНК.
3. У реплікації бере участь безліч органел, і 3D-анімація дає можливість побачити їх у дії: