При оцінці чутливості Staphylococcus spp. в першу чергу необхідно тестувати препарати, що мають основне клінічне значення: бета-лактами, макроліди, фторхінолони, аміноглікозиди і ванкоміцин.
Критерії інтерпретації результатів визначення чутливості Staphylococcus spp. (Граничні значення діаметрів зон пригнічення росту і МІК АБП) наведені в таблиці 14.
Бета-лактами
Препаратами вибору для лікування стафілококових інфекцій (викликаних як Staphylococcus aureus, так і коагулазонегативних стафілококами) є бета-лактамні антибіотики, отже, в першу чергу необхідно визначати чутливість стафілококів до цих препаратів.
Стійкість стафілококів до бета-лактамних АБП пов'язана або з продукцією бета-лактамаз, або з наявністю додаткового пеніциліну-зв'язуючого білка - ПСБ2а. Виявлення та диференціювання цих двох механізмів резистентності дозволяє надійно прогнозувати активність усіх бета-лактамних антибіотиків без безпосередньої оцінки чутливості до кожного з цих препаратів. При цьому необхідно враховувати наступні закономірності:
- Штами Staphylococcus spp. позбавлені механізмів резистентності, чутливі до всіх бета-лактамних АБП.
- Бета-лактамази (пеніцилінази) Staphylococcus spp. здатні гідролізувати природні і напівсинтетичні пеніциліни за винятком оксациліну і метициліну. Чутливість або резистентність до бензилпеніциліну є індикатором активності природних і напівсинтетичних аміно-, карбокси- і уреїдопеніцилінів. Решта бета-лактами з потенційною антистафилококковой активністю (антистафілококова пеніциліни, цефалоспорини I, II і IV поколінь і карбапенеми) зберігають активність щодо бета-лактамазопродукуючих штамів.
- Штами Staphylococcus spp, що володіють ПСБ2а, клінічно стійкі до всіх бета-лактамних АБП. Маркером наявності ПСБ2а є стійкість до оксациліну і метициліну. Такі штами історично отримали назву метіціллінорезістентних стафілококів (methicillin-resistant Staphylococcus spp -MRSS). Іншими термінами для позначення подібних штамів є MRSA - methicillin-resistant S.aureus і MRSE - methicillin-resistant S.epidermidis.
- Метицилін в даний час в клінічній практиці і в лабораторній діагностиці не застосовується, його практично повністю витіснив оксацилін, відповідно з'явився термін "оксаціллінорезістентность", що є повним синонімом терміна "метіціллінорезістентних".
Таким чином, визначення чутливості Staphylococcus spp. до бета-лактамних АБП повинне включати виконання двох тестів:
- Визначення чутливості до бензилпеніциліну або виявлення продукції бета-лактамаз (пеніциліназ).
- Визначення чутливості до оксациліну або виявлення ПСБ2а або кодує його гена mecA.
Визначення чутливості до бензилпеніциліну або виявлення продукції бета-лактамаз (пеніциліназ)
Визначення чутливості Staphylococcus spp. до бензилпеніциліну кілька утруднено тим фактом, що синтез бета-лактамаз у цього мікроорганізму є індуцібельная процесом (продукція ферменту посилюється після контакту з антибіотиком). В результаті цього при використанні стандартних методів серійних розведень і ДДМ можливе отримання результатів помилкової чутливості.
Рішенням даної проблеми може бути використання методу безпосереднього виявлення бета-лактамаз, заснованого на використанні дисків з нітроцефіном. Нітроцефіном є хромогенний цефалоспорин, який легко гідролізується під дією всіх бета-лактамаз з утворенням забарвленого продукту.
постановка тесту
Для проведення дослідження використовують чашку, на якій оцінювали чувствітельноcть досліджуваного штаму Staphylococcus spp. до пеніциліну і / або оксациллину ДДМ. З кордону зони пригнічення росту навколо диска з оксациллином бактеріологічною петлею забирається незначна кількість культури і наноситься на попередньо зволожений диск з нітроцефіном. Диск інкубують при кімнатній температурі до 1 год.
інтерпретація результатів
Поява червоного забарвлення свідчить про продукцію бета-лактамаз досліджуваним штамом мікроорганізму.
Штам, який продукує бета-лактамазу, розглядають як стійкий до природних і напівсинтетичних пеніцилінів (за винятком оксациліну) незалежно від конкретних результатів тестування до перерахованих АБП.
Визначення чутливості до оксациліну
При визначенні чутливості до оксациліну стандартними методами необхідно враховувати деякі особливості:
- для приготування інокулюму використовують тільки прямий метод суспендування колоній;
- тривалість інкубації до моменту обліку результатів визначення чутливості до оксациліну повинна становити не менше 24 год.
Особливості тестування ДДМ
- Необхідно використовувати диски, що містять 1 мкг оксациліну.
- При обліку результатів необхідно звертати увагу навіть на поодинокі дрібні колонії стафілококів, виявлені в межах зони пригнічення росту.
Особливості тестуванні методами серійних розведень
- У живильне середовище доцільно додавати NaCl (до кінцевої концентрації 2%).
Інтерпретація результатів тестування стафілококів до оксациліну
- Штами стафілококів, резистентні до оксациліну, повинні розглядатися як стійкі до ВСІХ бета-лактамних АБП.
- Результати визначення чутливості стафілококів до оксациліну і до інших бета-лактамних АБП можуть бути суперечливими, при цьому результати визначення чутливості до оксациліну є вирішальними.
- Визначати чутливість стафілококів до бета-лактамних АБП, крім бензилпеніциліну та оксациліну, недоцільно.
- Для метіціллінорезістентних стафілококів характерна наявність асоційованої резистентності до АБП інших груп. Виявлення у стафілококів множинної резистентності при чутливості до оксациліну вимагає проведення повторних досліджень.
- Слід звернути увагу на відмінності в умовах метіціллінорезістентних для S.aureus і коагулазонегативних стафілококів.
- При отриманні сумнівних результатів необхідно використовувати додаткові методи (скринінг на агарі - метод наведено нижче, пряме виявлення гена mecA або білка ПСБ2а).
Видача клініцистам результатів дослідження та рекомендацій по лікуванню
- При виділенні пеніцілліно- і метицилін-чутливих штамів стафілококів мікроорганізм вважається чутливим до всіх бета-лактамних АБП, а препаратами вибору будуть природні і амінопеніцилінів.
- При виявленні продукції бета-лактамаз і чутливості до оксациліну мікроорганізм є резистентним до природних пеніцилінів, аміно-, карбокси- і уреїдопеніциліни, але чутливий до оксациліну, інгібіторозахищених пеніцилінів і цефалоспоринів I - II поколінь, які є препаратами вибору в даному випадку. Відносно даних штамів будуть також активні цефалоспорини IV покоління і карбапенеми, проте перевагами в порівнянні з препаратами вибору вони не володіють.
- При виявленні метіціллінорезістентних штам вважається стійким до ВСІХ бета-лактамних антибіотиків, для лікування необхідно використовувати препарати інших груп, з яких препаратами вибору вважаються глікопептиди.
Додаткові методи виявлення метіціллінорезістентних
Найбільш надійним методом виявлення метіціллінорезістентнсті у стафілококів є безпосереднє визначення наявності гена mecA молекулярно-генетичними методами (за допомогою полімеразної ланцюгової реакції - ПЛР). Крім того, розроблений комерційний метод виявлення додаткового пеніцілліносвязивающего білка - ПСБ2а в реакції аглютинації.
У той же час скринінг на агарі для виявлення метіціллінорезістентних є високочутливим і специфічним методом, легко здійсненним в умовах рутинної роботи мікробіологічної лабораторії, проте він може бути використаний тільки для штамів S.aureus.
постановка тесту
Для проведення скринінгу готують чашки з агаром Мюллера-Хінтон, що містять 4% NaCl і 6,0 мкг / мл оксациллина. Хлористий натрій вносять в живильне середовище в необхідній кількості до автоклавування. Робочий розчин оксациліну додають в живильне середовище після автоклавування і охолодження середовища до 45 - 50 ° С. Для приготування робочого розчину оксациліну використовують субстанцію АБП з відомою активністю.
Мікробну суспензію слід готувати тільки методом прямого суспендування з декількох однотипних ізольованих колоній стафілокока, які виросли на чашці з неселективним поживним агаром, в стерильному фізіологічному розчині і доводити до каламутності 0,5 по МакФарланда (1,5 x 10 8 КУО / мл).
інокуляція
Для інокуляції чашок з агаром можна використовувати два методи: за допомогою микропипетки або за допомогою стерильного ватного тампона.
Метод I (мікропіпеткою)
- готують розведення 1: 100 стандартного інокулюму, що відповідає стандарту мутності 0,5 за МакФарланда, для отримання бактеріальної суспензії, що містить 1,5 x 10 6 КУО / мл (наприклад, додати 0,1 мл стандартної суспензії до 9,9 мл стерильного фізіологічного розчину);
- за допомогою микропипетки наносять краплю (10 мкл) розведеної стандартної суспензії на поверхню агару з оксациллином.
Метод II (за допомогою тампона)
- стерильний ватний тампон занурюють в пробірку із стандартизованою суспензією (0,5 по МакФарланда), потім віджимають надлишок вологи об стінку пробірки;
- культуру наносять тампоном або на обмежену поверхню (діаметром 10 - 15 мм), або на всю поверхню агару з оксациллином в чашці Петрі.
Штами S.aureus інкубують при температурі 35 ° С протягом 24 год, а коагулазонегативних стафілококів - протягом 48 год.
облік результатів
Після інкубації чашки ретельно переглядають в світлі:
- поява видимого зростання більше 1 колонії або вуалеподібного зростання на місці нанесення культури означає стійкість даного штаму до оксациліну (метициліну);
- при відсутності росту на місці нанесення культури досліджуваний штам враховується як чутливий до метициліну (оксациліну).
- при сумнівних результатах, а також для штамів, виділених у хворих з клінічно неефективною терапією і у хворих з серйозними інфекціями, необхідно провести розгорнене дослідження з визначенням МПК до оксациллину і гена mecA.
Контроль якості
- Дослідження проводять при обов'язковому контролі росту досліджуваних культур на агарі Мюллера-Хінтон з 4% NaCl без оксациліну (культуру наносять так само, як на агар з оксациллином).
- Паралельно з досліджуваними тестують також контрольні штами: S.aureus ATCC 38591 - резистентний; S.aureus ATCC 29213 - чутливий.
Макроліди і лінкозаміди
Макроліди і лінкозаміди є альтернативними препаратами для лікування стафілококових інфекцій. У дослідження необхідно включати:
- Одного з представників 14-ти і 15-членних макролідів. Повна перехресна резистентність між окремими представниками.
- Кліндаміцин. Повна перехресна резистентність між 16-членні макроліди та лінкозамідами.
Наведений вибір препаратів визначається закономірностями перехресної резистентності між антибіотиками зазначених підгруп.
фторовані хінолони
Останнім часом відзначається підвищення інтересу до фторхінолонів як до препаратів для лікування стафілококових інфекцій (особливо шкіри і м'яких тканин). Нові представники цієї групи АБП (антіпневмококковие фторхінолони - левофлоксацин, спарфлоксацин, моксифлоксацин і ін.) Мають підвищену активність відносно Staphylococcus spp. в порівнянні з традиційними препаратами. Між перерахованими підгрупами препаратів немає повної перехресної резистентності. Антіпневмококковие препарати часто зберігають активність щодо штамів, стійких до інших фторхінолонів.
аміноглікозиди
На практиці необхідно враховувати деякі особливості інтерпретації результатів, отриманих in vitro. Так, при детекції стійкості до гентаміцину виділений штам слід вважати стійким до всіх аміноглікозидів. У зв'язку з цим гентаміцин повинен включатися в набір для тестування в обов'язковому порядку. У той же час вкрай рідко можуть зустрічатися штами, стійкі до інших аміноглікозидів при чутливості до гентаміцину.
ванкоміцин
Ванкоміцин є одним з препаратів вибору (поряд з оксазолідінонов) для лікування інфекцій, викликаних оксацилінорезистентними штамами. Поява повідомлень про стійкість стафілококів до глікопептидів вимагає уважного ставлення до оцінки результатів дослідження.
додаткові препарати
Оксазолідінони є важливим досягненням в лікуванні інфекцій, викликаних оксацилінорезистентними штамами, в тому числі і стійкими до глікопептидів. У той же час, необхідно мати на увазі, що вже відомо про формування стійкості до антибіотиків цієї групи.
інші препарати
- Ко-тримоксазол.
- Хлорамфенікол.
- Фузидієва кислота.
- Тетрацикліни.
- Рифампіцин.
Значення перерахованих препаратів в лікуванні стафілококових інфекцій, викликаних метицилін штамами, невелике, так як вони поступаються за активністю бета-лактамів. Їх клінічна ефективність при інфекціях, викликаних оксацилінорезистентними штамами, вивчена недостатньо.
Рифампіцин, ко-тримоксазол і фузидієвої кислоту не можна рекомендувати як засіб монотерапії через високу частоти селекції резистентності в процесі лікування.
Формувати конкретний набір антибіотиків для оцінки антібіотікочувствітельності стафілококів найбільш доцільно на підставі даних про частоті поширення в стаціонарі метицилінорезистентності. При відсутності або низькій частоті метицилінорезистентності цілком достатньо обмежитися оцінкою чутливості до оксациліну (в плані нагляду), макролідів і, можливо, ще до 1 - 2 препаратів, реально застосовуються в конкретному стаціонарі для лікування стафілококових інфекцій. У разі ж високої частоти розповсюдження метицилінорезистентності в дослідження необхідно включати широке коло антибіотиків.
Інформація загального та комерційного характеру
Інформація наукового характеру
- Уреаплазмоз: діагностика, збудники, профілактика - сучасний погляд
- Сучасні методи визначення антібіотікочувствітельності
- Лабораторна діагностика гонореї
- Сучасна лабораторна діагностика туберкульозу легенів
- Діагностика мікоплазмозу: тепер просто і дешево
- Антибіотики для лікування уреаплазмоза і мікоплазмозу
- Хромогенні поживні середовища
- Лабораторні методи діагностики трихомоніазу (огляд літератури)
реєстраційні посвідчення
- Набір дисків для визначення чутливості до протимікробних препаратів - 1 (НД-ПМП-1)
- Набір реагентів "Діагностикум еритроцитарний коровий антигенний сухий для реакції пасивної гемаглютинації (РПГА)"
- Набір реагентів для візуального виявлення Mycoplasma hominis (мікоплазми-50)
- Набір реагентів для візуального виявлення Ureaplasma urealyticum (УРЕАПЛАЗМА-50)
ФБУН НДІ епідеміології
і мікробіології імені Пастера
Відділ нових технологій