Метод визначення концентрації нуклеїнових кислот (ДНК або РНК) в розчині заснований на існуванні у ДНК і РНК максимуму поглинання при довжині хвилі 260 нм. Це означає, що в розчинах нуклеїнових кислот максимальна фотометрична абсорбція спостерігається при 260 нм і прямо корелює з концентрацією ДНК або РНК.
Визначення чистоти препарату ДНК або РНК
Ставлення поглинання при довжинах хвиль 260 нм і 280 нм (260нм / 280нм) показує чистоту препарату ДНК або РНК. Препарат вважається чистим, якщо відношення значень 260нм / 280нм приблизно дорівнює 1.8 для ДНК і 2.8 для РНК. У разі менших значень показника 260нм / 280нм препарат містить велику кількість домішок білка, фенолу чи інших контамінують агентів, що мають значне поглинання при 280 нм.
Іншим показником чистоти препарату ДНК або РНК є ставлення значень поглинання 260нм / 230нм. У разі чистого препарату це співвідношення зазвичай одно 1.8 - 2.2. Менші значення коефіцієнта 260нм / 230нм свідчать про забруднення препарату компонентами, які залишаються після процедури виділення ДНК або РНК.
Метод визначення концентрації ДНК і РНК в розчині: на малюнку показаний спектр поглинання розчину ДНК у воді з максимумом при 260 нм
Концентрація препарату ДНК - 3.6 мкг / мкл. Кювету з довжиною оптичного шляху 1 мм, обсяг - 200 мкл
Ставлення поглинання при довжинах хвиль 260 нм і 280 нм (коефіцієнт 260нм / 280нм) дорівнює 1.73, що свідчить про відносно високій чистоті препарату ДНК
Спектр поглинання отриманий як результат автоматичного (програмного) усереднення результатів 30 вимірювань тривалістю по 10 мс
Визначення концентрації нуклеїнових кислот і чистоти препарату можна проводити в кюветах об'ємом 200 мкл (довжина оптичного шляху 1 мм), або 1000 мкл (довжина оптичного шляху 10 мм)
Можливо побудова звітних бланків з графіками спектра поглинання і значеннями поглинання при певній довжині хвилі для 12 зразків на одному бланку
Значення повного спектра поглинання можуть бути конвертовані в формат MS Exel
При постановці вимірювання зразок ДНК розбавляють дистильованою водою в 40 разів (до 5 мл розчину ДНК додають 195 мкл води). Вимірювання поглинання при 260 нм проводять в кюветі з довжиною оптичного шляху 1 мм, використовуючи воду в якості референсу. Значення концентрації ДНК в вихідному розчині (мкг / мкл) знаходять, множачи значення поглинання при довжині хвилі 260 нм на К = 20.
РНК розбавляють водою в 10 разів (до 20 мкл розчину ДНК додають 180 мкл води). Вимірювання поглинання при 260 нм проводять в кюветі з довжиною оптичного шляху 1 мм, використовуючи воду в якості референсу. Значення концентрації РНК в вихідному розчині (мкг / мкл) знаходять, множачи значення поглинання при довжині хвилі 260 нм на К = 4.