У мікробіології широко застосовуються різні методи забарвлення бактерій. Звичайно, можна проводити спостереження і без цих складних маніпуляцій, але тоді при мікроскопірованіі ви майже нічого не побачите, адже коефіцієнт світлопереломлювання бактерій близький до коефіцієнта світлопереломлювання рідини, в якій вони живуть. Для того, щоб бактерії або якісь їхні внутрішні або зовнішні структури чітко виділялися на тлі, застосовують різні барвники. Сьогодні ми розглянемо методику забарвлення за Грамом, розроблену в 1884 році датським лікарем Гансом Крістіаном грам.
Виконання методики починається з приготування фіксованого мазка культури мікроорганізмів. На предметне скло наноситься крапля фізіологічного розчину, в яку мікробіологічної петлею, пропалені в полум'я пальника, вносяться досліджувані бактерії. Це може бути як миттєвий зішкріб або мазок, так і заздалегідь вирощена колонія. Всі етапи повинні проводитися в умовах асептики, бажано в зоні полум'я пальника. Демонстрований спосіб виконання методики покликаний лише відобразити послідовність внесення необхідних для забарвлення речовин і роз'яснити роль кожного етапу.
Суть методики в візуальному поділі бактерій на дві групи - грампозитивні і грамнегативні. Перші в результаті диференціації виглядають під мікроскопом як пофарбовані в синій чи фіолетовий колір, а другі - в рожевий. Основна різниця між ними в тому, що грамнегативнібактерії гірше сприймають барвник через більш складної будови оболонки. Зокрема, у них є додаткова мембрана поверх клітинної стінки, що перешкоджає проникненню непотрібних речовин. При цьому пептидоглікановому шар у них тонше, ніж у грампозитивних бактерій. Саме ці особливості дозволяють їм виявляти патогенність. У медичній мікробіології майже не вивчаються грампозитивні бактерії, оскільки далеко не всі з них здатні викликати хвороби.
Нанесений на скло мазок висушується на повітрі або високо над полум'ям пальника, щоб не допустити закипання і денатурації білка, а потім фіксується шляхом пронесення через полум'я протягом короткого часу. Таким чином мікроорганізми гинуть і надійно приклеюються до скла.
Тепер настає час внесення барвника. Спершу відбувається забарвлення генціанвіолетом. Це основний барвник трифенілметанового ряду: суміш пента- і гексаметілпараозанілінов з невеликою кількістю декстрину і фуксину. Він використовується в медицині не тільки як барвник, а й як антисептичний засіб. Протимікробні властивості пояснюються високою проникністю крізь бактеріальні оболонки і впливом на окислювально-відновні процеси.
Забарвлення триває 1-2 хвилини, після чого генціанвіолет зливають і заливають зразки розчином Люголя. Ця речовина, думаю, добре знайоме всім - їм обробляють горло при ангіні. Розчин Люголя - це з'єднання йоду з йодидом калію, що надає йому гарну водорастворимость. З'єднуючись з шматочками генціанвіолета, який проник в клітинні стінки бактерій, йод утворює міцне з'єднання синьо-фіолетового кольору. Реакція теж триває 1-2 хвилини.
Тепер прийшов час диференціації, тобто поділу грам позитивних та грам бактерій. Для цього скло з мазком кілька разів занурюють у посудину з 96% -ним етиловим спиртом до тих пір, поки що стікають краплі не зрівняються за кольором зі спиртом в склянці. При цій процедурі синьо-фіолетовий комплекс вимивається з стінок грамнегативних бактерій, залишаючись тільки в стінках грампозитивних.
Для того, щоб грамнегативні бактерії не здавалися безбарвними, мазок промивається водою і додатково забарвлюється водним розчином фуксину протягом тих же магічних 1-2 хвилин. Оскільки в стінці грампозитивних бактерій вже є барвник, вони фуксином не фарбується. А грамнегативнібактерії набувають рожевий колір. Мазок остаточно промивається водою, висушується і препарат готовий до мікроскопірованію.
Грамнегативнібактерії (х1600):
