Отримання тонких зрізів з зразків досліджуваних тканин можливо тільки після їх просочування досить щільними середовищами, якими є парафін і целлоидин.
Парафін - суміш високомолекулярних насичених вуглеводнів, що отримується при перегонці нафти. Сорти парафіну, які використовуються в якості середовища для гістологічної заливки, мають температуру плавлення від 48 ° до 60 ° С. Найбільш зручний в повсякденній роботі парафін з температурою плавлення 52 ° -56 ° С. Технічний, харчової та медичний парафін без додаткової підготовки не дозволяють виробляти заливку, що забезпечує високу якість зрізів. У гістологічної лабораторії бажано використовувати очищені сорти парафіну з додаванням воску або спеціально розроблені на основі парафіну середовища з добавками, що модифікують (Paraplast -Sigma (CШA), Histoplast - Shandon (CШA), Histomix - БіоВітрум (Росія).
Просочення парафіном проводять в термостаті, що забезпечує підтримання температури на 1-2 градуси вища за температуру плавлення використовуваного парафіну (зазвичай встановлюють температуру 58 ° С).
Оскільки розплавлений парафін і етанол не змішуються, з зневодненого матеріалу слід видалити спирт (або метилсаліцилат) за допомогою проміжного середовища - розчинника парафіну, що змішується з етанолом. В якості таких проміжних середовищ можна використовувати хлороформ, авіаційний бензин, петролейний ефір, ксилол, бензол, толуол, октан, гексан та ін.
Абсолютний спирт придатний для зневоднення (в якості абсолютного спирту), якщо його міцність не нижче 98 °. У практичній роботі найбільш часто застосовують хлороформ. При доступності абсолютного етанолу, хлороформу слід віддати перевагу менш токсичний петролейний ефір, який краще видаляє етанол і дозволяє досягти більш високої якості просочення парафіном.
Можна рекомендувати наступні схеми проводки і просочування матеріалу.
1. Заливка в парафін з використанням хлороформу
Зневоднені об'єкти поміщають послідовно в:
Суміш абсолютного етанолу з хлороформом (1: 1) 1-2 ч
Хлороформ (I) 1ч,
Хлороформ (II) 1ч
Хлороформ (III) 1 ч
Хлороформ-парафін (1: 1) при 37 ° С в термостаті 12-24 год
Проводять через 3 порції розплавленого парафіну (в термостаті при 56 ° -58 ° С) по 40-60 хв
2. Заливка в парафін з використанням петролейного ефіру.
Зневоднені об'єкти поміщають послідовно в:
Петролейний ефір (I) 30-60 хв
Петролейний ефір (II) 30-60 хв
Петролейний ефір (III) 30-60 хв
Петролейний ефір-парафін (1: 1) при 37 ° С в термостаті 3-24 год
Проводять через 2 порції розплавленого парафіну (в термостаті при 5б ° -58 ° С) по 60 хв.
3.Схема проводки матеріалу і заливки в парафін після фіксації об'єктів у рідини Буена, що застосовується у Відділі морфології НІІЕМ РАМН
Перед фіксацією дрібні, тонкі і легко деформуються об'єкти необхідно помістити на шматочок щільного паперу.
Фіксація в рідини Буена 1 добу. (При кімнатній температурі).
Коротка промивка у водопровідній воді 1-15 хв.
70 ° етанол 1 добу.
80 ° етанол 1 добу. (Можна залишити на термін до 1 тижня)
90 ° етанол 1 добу.
96 ° етанол 1 добу.
Абсолютний етанол 1 добу.
Абсолютний етанол-хлороформ (1: 1) 2-3 ч
Хлороформ (I) 90 хв
Хлороформ (II) 90 хв
Хлороформ-парафін 1: 1 в термостаті 37 ° залишити на ніч
Парафін 1 -1 годину (в термостаті 56-58 ° С)
Парафін 2 - 1 година (в термостаті 56-58 ° С)
Парафін 3 - 1 година (в термостаті 56-58 ° С)
Незадовільна якість заливки при використанні хлороформу може бути обумовлено застосуванням хлороформу "для спектроскопії", в який доданий етанол, розливного хлороформу (при використанні недостатньо просушених після промивання ємностей) та реактиву, які тривалий час зберігався на світлі.
При відсутності можливості використовувати абсолютний етанол, цей етап проводки можна пропустити, однак якість просочення парафіном при цьому може бути дещо гірше. Після зневоднення з використанням метилсалицилата (або метілбензоата) цей етап слід пропустити. Якість заливки при цьому не погіршиться.
Після закінчення проводки здійснюється заливка - об'єкт поміщають в формочку (паперову, пластикову або металеву і заливають свіжою порцією розігрітого до 58 ° -65 ° С парафіну. У разі необхідності особливої орієнтації шматочка тканини при виготовленні зрізів, за допомогою підігрітих препаровальной голки і очного пінцета можна повернути матеріал, звернувши площину різання на дно формочки.
Для отримання кращої консистенції парафинового блоку і забезпечення більш високої якості зрізів виробляють прискорене охолодження залитих об'єктів. Для цього формочки (паперові або пластикові) опускають в холодну воду або поміщають на охолоджену поверхню (на спеціальний охолоджуючий столик або в камеру холодильника при + 4 ° С).
З затверділого парафіну (зазвичай через годину і більше після заливки) підігрітим скальпелем вирізують блоки, таким чином, щоб по периметру шматочка залишалася облямівка парафіну 1-2 мм. У разі прямокутних шматочків, які при виготовленні зрізів повинні розташовуватися більш довгою стороною паралельно лезу мікротомних ножа, парафін з більш коротких сторін може бути підрізав до краю тканини. Приготовлені блоки за допомогою розігрітих скальпеля або спеціальної лопатки (шпателя) прикріплюють до дерев'яного блокодержателю, на якому олівцем, ручкою або фломастером підписують номер об'єкта. До виготовлення зрізів можна приступати після охолодження блоку.
Металеві та пластикові (з поліпропілену, полістиролу і т.п.) форми слід перед заливкою прогріти в термостаті.
Розігрів заливного парафіну понад 56 ° С рекомендується в зв'язку з можливістю швидкого застигання парафіну, вийнятого з термостата. що призводить до нерівномірного заливці блоку зі збереженням пустот.
До тек пір як парафін не застигне, формочки повинні плавати на поверхні води. Повне занурення в воду до застигання парафіну робити не рекомендується в зв'язку з небезпекою
проникнення води всередину блоку і його розтріскування і деформації.
Не рекомендується тривале охолодження при температурах нижче 0 ° С в зв'язку з небезпекою появи тріщин в блоці.
Застосування целлоидин при заливці в парафін
У разі заливки в парафін щільних тканин, з яких важко виготовити якісні зрізи, і при необхідності збереження форми легко деформуються об'єктів (наприклад ембріонів) рекомендується комбінована заливка в целлоидин-парафін.
Існує кілька методів, мета яких полягає в первісної просочення тканин слабкими розчинами целлоидин. Наведений спосіб, на наш погляд, найбільш вдалий (по простоті і якості результатів).
Після зневоднення в абсолютному етанолі (або 96% -ному) шматочки переносять в суміш рівних обсягів етанолу і метилсалицилата на 1-24 год (до просвітління). Потім переносять об'єкти в чистий метилсалицилат і залишають на 12-24 год. Перекладають матеріал в 1-2% розчин целлоидин в метилсаліцилат і залишають на 3-7 добу. Відмивають об'єкт від метилсалицилата петролейним ефіром (хлороформом) і переносять в петролейний ефір - парафін (хлороформ-парафін 37 ° С) або відразу в перший заливний парафін. Далі продовжують заливку відповідно до однієї з рекомендованих прописів.
Для приготування розчину целлоидин в метилсалицилата беруть 1-2 г целлоидин в пластівцях і поміщають в щільно закривається ємність зі 100 мл метилсалицилата, ставлять в термостат (37 ° С) на 2-3 тижнів. Раз на добу ємність бажано струшувати для прискорення розчинення целлоидин. Готовий розчин являє собою прозору, злегка жовтувату сиропообразную рідина, яка може зберігатися тривалий час при кімнатній температурі.