- Тагіров Махсуд Тагирович - кандидат біологічних наук
- Артеменко Олексій Борисович - кандидат сільськогосподарських наук
- Терещенко Олександр Володимирович - кандидат біологічних наук
Довготривале збереження генетичного різноманіття тварин і рослинних ресурсів одна з основних задач нації. Виробництво тварин життєво важливо для людства і збереження їх генетичного різноманіття є способом страхування нашого майбутнього. За минулі століття було створено багато місцевих, національних та інтернаціональних порід тварин. Багато породи займають міцні позиції (місцеві, регіональні, національні та / або інтернаціональні) завдяки певним характеристикам, продуктивності або адаптаційним якостям. На даний момент в світі існує тенденція зменшення кількості інтернаціональних порід тварин, що в свою чергу призвело до зростання кількості рідкісних порід і до зниження загальної кількості всіх порід. Як в Європі, так і в усьому світі, має місце генетична ерозія, втрата або ризик втрати порід. В результаті селекції, зміни порід або генетичного дрейфу піддається тиску як межпородное, так і Внутріпородний різноманітність. Тому необхідно докладати зусиль щодо консервації, які охопили б як всередині -. так і межпородное різноманітність. Розрізняють in situ (в національних парках, заповідниках) і ex situ (в зоопарках, Кріобанку) програми консервації. У загальному випадку in situ консервація краще як механізм збереження генетичних ресурсів. Для того щоб порода була вдало збережена, вона повинна розвиватися і пристосовуватися до зміни навколишнього середовища.
Однак ex situ консервація є важливим механізмом, щоб уникнути необоротних втрат порід і генів, для відтворення породи, для страхування наших ресурсів від санітарних катастроф, для підтримки розведення в малих популяціях і для збереження генетичного різноманіття (генів, властивостей, порід) в селекційних програмах. Ex situ консервація може бути проведена за допомогою збереження в живому вигляді (наприклад, зоопарки) і шляхом кріоконсервації (в рідкому азоті). У багатьох країнах західної Європи вже створені національні банки по збереженню біорізноманіття тварин. Кожен з них має свою інфраструктуру, але при цьому інтегрований до складу світового банку генетичних ресурсів під керуванням Всесвітньої організації по продуктам харчування і сільського господарства. В Україні тільки починає розроблятися єдина програма по збереженню генетичних ресурсів тварин. У зв'язку з цим виникає необхідність науково обгрунтованого розрахунку норм збереження тих чи інших видів тварин і типів біологічного матеріалу. У даній роботі робиться спроба такого розрахунку для різних видів сільськогосподарської птиці при збереженні біологічного матеріалу в кріобанку генетичних ресурсів.
Відбір донорів для консервації.
Донори повинні відповідати всім санітарним вимогам і мати морфологічні та поведінкові характеристики, що полегшують збір генетичного матеріалу. Різні цілі кріоконсервації можуть зажадати збереження різних типів генетичної різноманітності, яких можна здійснити шляхом випадкової селекції донорів або відбором за певним критерієм.
Збереження репрезентативного зразка породи розглядається як найбільш загальний випадок. Для збереження репрезентативного зразка генетичної мінливості породи особини повинні підбиратися випадковим чином. На практиці цього можна досягти шляхом селекції: а) на основі родоводу інформації, віддалено пов'язаних тварин; б) тварин з різних стад і місць проживання, беручи до уваги генетичний потік між стадами і зонами. Якщо неможливо знайти всіх необхідних тварин в популяції, для збереження бажаної генетичної мінливості потрібно отримати певних донорів шляхом відповідних схрещувань.
Кількість особин - донорів для консервації.
Кількість особин, використаних в якості донорів, впливає на генетичну мінливість зберігається в кріобанку матеріалу. Виходячи з гетерозиготности як параметра генетичної мінливості, відсоток гетерозиготности зберігається в банку породи дорівнює 1 (1 / (2N)), де N - кількість особин-донорів. Часто пропонується використання 25 донорів, відповідне 98% гетерозиготности. Кількість донорів також залежить від обсягу матеріалу, який можна отримати від кожного донора, що в свою чергу залежить від видової приналежності. Коли необхідно збереження існуючого різноманіття певної аллели, ймовірність того, що дана аллель виявиться в кріобанку дорівнює 1 (1-р) 2N. де р - частота алелі в конкретній популяції, N - кількість донорів. Для збереження певних генотипів і племінних ліній необхідна певна кількість донорів. У малих популяціях може виникнути необхідність отримання певних самок або самців шляхом відповідних схрещувань.
Тип матеріалу для консервації.
Основні види біологічних матеріалів, які накопичуються в кріобанку, мають відмінності за обсягом генетичної інформації, якою вони володіють і ефективності збереження. У птахів на даний момент для цілей довгострокового зберігання шляхом кріоконсервації можна використовувати сперму і ранні ембріональні клітини.
Сперма може бути використана для реконструкції порід через поглинальні схрещування, але певний відсоток генів залишиться від материнської родоначальної популяції. Наприклад, для відновлення 95% генома породи необхідні п'ять генерацій поліпшення породи шляхом поглинального схрещування.
Використання ембріональних стовбурових або первинних зародкових клітин, присутніх в ембріоні птахів на ранніх стадіях розвитку, передбачає отримання химерних особин по лінії статевих клітин після ін'єкції заморожено-відтанути суспензії клітин. Хоча ефективність цих методів ще знаходиться на досить низькому рівні, в деяких країнах, зокрема, Канаді, США ранні ембріональні клітини птахів вже використовуються для довготривалого зберігання в кріобанку генофонду птахів.
Після того як вівця Доллі була відтворена з соматичних клітин стало ясно, що метод клонування можна використовувати для відтворення тварин. Даний метод був використаний для клонування і деяких інших видів тварин: коней, корів, свиней. Консервація соматичних клітин - дуже дешевий і ефективний метод збереження широкого спектра генетичної мінливості при обмеженому бюджеті. Але до сих пір немає налагодженого методу дозволяє відтворення окремих особин птахів або тварин, а також їх ліній і порід.
Кількість матеріалу для консервації.
Рекомендується дублювати кількість матеріалу і зберегти дублікати в різних місцях.
Реконструкція порід.
Випадкові демографічні фактори, такі як вибракування стада по санітарних причин або ліквідація ферми, і негативні демографічні тенденції можуть сильно зменшити розмір малих популяцій і привести до їх зникнення. Збереження матеріалу, що дозволяє реконструкцію породи, є страховкою від ризику їх втрати. Однак слід зауважити, що реконструкція породи може мати деякі обмеження: а) у зв'язку з великими витратами, пов'язаними зі збереженням великих обсягів, реконструйовані породи повинні проходити через "пляшкове горло" минимизированного кількості збережених генотипів в кріобанку, що означає втрату генетичної мінливості і слабкі селекційні можливості протягом кількох генерацій; б) матеріал часто зберігається, коли порода вже сильно постраждала і її генетична мінливість можливо вже еродована. На закінчення, за кількістю зберігається матеріалу для реконструкції породи необхідно, перш за все, мати на увазі наступні аспекти:
- Кількість донорів. Ми рекомендуємо Вам зробити матеріал принаймні від 25 донорів. Ці тварини стануть родоначальниками воссоздаваемой популяції.
- Розмір популяції. При ресинтезі розмір популяції пов'язаний з її потенціалом для зростання і розвитку і з можливістю зведення до мінімуму втрат генетичної мінливості в ході реконструкції. У птахівництві розроблені різні схеми збереження колекційних стад птиці, де поголів'я може коливатися в широких межах: від 80 (40 курочок і 40 півників) до 500 курей і 20-50 півників. Чим менше поголів'я, тим більш суворий облік схем схрещувань і контроль за відбором та оцінкою потомства потрібно. Якщо враховувати, що при реконструкції породи можна забезпечити найсприятливіші умови і суворо дотримуватися всіх необхідних вимог протягом усього періоду відновлення, то за основу можна взяти схему, що вимагає мінімальну кількість поголів'я воссоздаваемой породи, тобто 40 півнів і 40 курей. Запліднив курей кожен раз спермою різних птахів можна досягти незначного коефіцієнта інбридингу (не більше 0,49% протягом 5 років) [4]. Слід зазначити, що важливо не число особин в зберігається популяції, а її ефективна чисельність, яку визначають за формулою:
де N-ефективна чисельність популяції, Nf - чисельність самців, Nm- чисельність самок.
Реконструюються популяція в першому поколінні буде складатися з 80 особин.
Кількість доз сперми, які закладаються на зберігання в криобанк генетичних ресурсів.
Насіння використовується для ресинтезу породи шляхом серії зворотних схрещувань з групою самок іншої породи. Кількість збережених доз залежить від:
- кількості запліднених яєць, одержуваних після одного штучного осіменіння самок деконсервованих спермою;
- кількості фертильних самок очікуваного від кожної матері протягом життєвого циклу. Ця величина залежить від величин несучості породи, заплідненні і виводимості яєць, відсотки виживання і селекції від народження до статевозрілого віку;
- відсотка геному зберігається породи, який ми хочемо мати в ресинтезувати породі, який залежить від кількості генерацій поліпшують схрещувань і дорівнює 1-0,5n, де n - кількість генерацій;
- кількості самок і самців, яке ми хочемо відтворити.
Кріоконсервація сперми півнів.
25 курочок х 3 = 75 добових курчат.
Для отримання 75 курчат при виведенні 60% (після використання кріоконсервованої сперми) потрібно закласти на інкубацію:
75 курчат / 0,6 = 125 інкубаційних яєць.
Вихід інкубаційних яєць становить 80%, тому необхідно отримати від курей:
125 інкубаційних яєць / 0,8 = 156 яєць.
Група з 25 курей знесе за один день при інтенсивності яйцекладки 70%. 25 курей х 0,7 = 17,5 яєць в день.
156 яєць буде отримано за: 156 яєць / 17,5 яєць в день = 9 днів
Технології кріоконсервування сперми птахів передбачають осіменіння птиці два рази в тиждень і збір яйця можна починати через дві доби після першого штучного осіменіння птиці, тому все буде потрібно 4 осіменіння птиці. На 4 запліднення 25 голів курей буде витрачено:
4 запліднення х 25 доз = 100 доз сперми півнів.
Поглинальні схрещування птиці необхідно проводити протягом 5 років, з отриманням в кінці 40 голів курочок і 40 голів півників. Для цього необхідно зберігати в кріобанку:
100 доз х 4 роки = 400 доз сперми необхідні в перші 4 роки для запліднення 25 курочок і 125 спермадоз для запліднення 40 курочок в п'ятий рік.
Всього потрібно заморозити 525 спермадоз.
При зберіганні передбачається подвійне резервування: 525 спермадоз х 2 = 1050 спермадоз.
На зберіганні в банку генетичних ресурсів необхідно мати 1050 доз сперми півнів від однієї породи (популяції).
Кріоконсервація сперми самців водоплавної птиці (гуси, селезні).
25 голів х 2,1 = 52 добових гусеня (каченяти).
Для отримання 52 гусенят при виведенні 70% (після використання кріоконсервованої сперми) потрібно закласти на інкубацію:
52 гол. / 0,7 = 75 яєць.
Вихід інкубаційних яєць становить 90%, тому необхідно отримати від гусей:
75 яєць / 0,9 = 83 яйця.
Група з 25 гусок знесе за один тиждень 50 яєць, 83 яйця буде отримано за 11 днів.
Технології кріоконсервування сперми гусаків передбачають осіменіння птиці два рази в тиждень і збір яйця можна починати через дві доби після першого штучного осіменіння птиці, тому все буде потрібно 4 осіменіння птиці.
На 4 запліднення 25 гусок буде витрачено 100 доз деконсервованих сперми гусаків.
Поглинальні схрещування птиці необхідно проводити протягом 5 років, з отриманням в кінці 40 голів гусок і 40 голів гусей. Для цього необхідно зберігати в кріобанку:
100 доз х 4 роки = 400 доз сперми
необхідні в перші 4 роки для запліднення 25 гусок і 125 спермадоз для отримання 40 гусок і гусаків в п'ятий рік. Всього потрібно заморозити 525 спермадоз. При зберіганні передбачається подвійне резервування: 525 доз х 2 рази = 1050 спермадоз.
На зберіганні в банку генетичних ресурсів необхідно мати 1050 спермадоз сперми гусаків або селезнів.
Кількість ембріональних клітин (ембріонів), які закладаються на зберігання в криобанк генетичних ресурсів.
Також як і у випадку сперми, збереження ембріональних клітин має на меті відтворення 40 самок і 40 самців від 25 донорів. Кількість ембріонів, від яких будуть приготовлені тотальні суспензії клітин для заморожування, залежить від кількості репродуктивних тварин, яких ми хочемо отримати, виводимості оперованих яєць, відсотки хімерізма по лінії статевих клітин, відсотки виживання і селекції від народження до статевозрілого віку.
При розрахунку кількості ембріональних клітин, які закладаються на зберігання в криобанк, також виходимо з необхідності відновлення ефективної чисельності популяції рівний 80 голів (40 самок і 40 самців).
На даний момент експериментально доведена можливість кріоконсервації ембріональних клітин курей, виділених на стадії Х (відповідає стадії свіжознесених яйця) [6,7]. При ін'єкції заморожено-відтанути клітин від однієї породи в ембріони-реципієнти іншої породи отримані химерні особини по лінії статевих клітин. Схрещування між собою таких химер дозволяє відновити в чистому вигляді зберігається породу в першому поколінні химерних особин [8,9].
За життєвий цикл від однієї курочки, химерної по лінії статевих клітин, можна отримати 120 статевозрілих нащадків, з яких 5% складають особи донорського типу:
1120 гол. х 0,05 = 6 голів.
Для відтворення ефективної чисельності (80) необхідно використовувати:
80 гол. / 6 гол. = 13 курочок-химер по лінії статевих клітин.
Якщо враховувати співвідношення статей 1: 1, то необхідно отримати:
13 химер х 2 = 26 химер по лінії статевих клітин.
Для виробництва 26 химер по лінії статевих клітин при ефективності 10% потрібно отримати:
26 химер / 0,1 = 260 химерних курчат.
Для отримання 260 химерних курчат необхідно ін'єктувати (при виводимості ін'єктовані яєць 30%):
260 химер / 0,3 = 866 яєць.
Кількість первинних зародкових клітин, попередників сперматозоїдів і яйцеклітин, в ембріоні на використаної стадії розвитку становить не більше 30 - 40 штук. Тому, для ін'єктування 866 яєць необхідно використовувати суспензію клітин, приготовлену не менше ніж з 450 ембріонів.
З огляду на необхідність дублювання зберігається матеріалу для забезпечення надійного зберігання породи або популяції птиці, рекомендується заморозити клітини від 900 ембріонів.
За іншими видами сільськогосподарської птиці (індички, перепела, цесарки) ще не розроблені надійні способи збереження генетичного різноманіття шляхом кріоконсервації.
Ветеринарно-санітарні вимоги до збереження генофонду
Згідно "Ветеринарного законодавства" і схем застосування вакцин батьківські стада курей (донори) необхідно піддавати специфічну профілактику проти вірусних інфекцій з використанням живих та інактивованих біопрепаратів.
У перший місяць життя курчат вакцинують живими вакцинами проти хвороби Марека, реовирусной інфекції, ньюкаслської хвороби, інфекційного бронхіту курей, хвороби Гамборо; ремонтний молодняк віком 90-120 днів - інактивованих вакцинами проти ньюкаслської хвороби, інфекційного ларинготрахеїту, інфекційного бронхіту курей, хвороби Гамборо, реовирусной інфекції, грипу, інфекційної анемії, інфекційного енцефаломієліту з періодичним визначенням напруженості імунітету у прищепленої птиці, а так само проведення діагностичних досліджень на пуллороз-тиф, сальмонельоз, туберкульоз, стрептококозу, мікоплазмоз, нейссеріоз; терміни санації приміщень і контроль якості дезінфекції.
Батьківські стада (донори) качок імунізують живою вакциною проти вірусного гепатиту, а гусей - живою вакциною проти вірусного ентериту згідно повчанням щодо їх застосування.
Сперму, яка буде піддаватися кріоконсервації і надалі використовуватися для відновлення генофонду рідкісних порід птиці, необхідно піддавати бактеріологічному контролю згідно ДСТУ "Сперма півнів, індиків, гусей" (табл.1).
Таблиця 1 - Мікробіологічні показники сперми птахів
Характеристика і норма