Використання для транспортування багатьох зразків біоматеріалу (гній, кишковий вміст і т.п.) звичайних поживних середовищ є, найчастіше, серйозною помилкою, оскільки в них йде швидке розмноження менш вимогливих сапрофітних мікроорганізмів. Фізіологічний розчин, який часто застосовують для цієї мети, не забезпечує підтримання стабільних рівнів редокс-потенціалу і рН, а це, в свою чергу, суттєво обмежує життєздатність багатьох патогенних бактерій.
В даний час в клініці в якості транспортних середовищ (консервантів) використовуються різні за складом композиції з різним ступенем поживної цінності. Використання тієї чи іншої з них визначається відповідними інструкціями, методичними рекомендаціями та вказівками, в тому числі затверджених МОЗ РФ.
Це можуть бути буферні розчини, які містять тільки мінеральні солі - ізотонічний розчин хлориду натрію або фосфатно-буферний розчин, а також консерванти, що містять органічні речовини - буферно-гліцериновий сольовий розчин, гліцериновий консервант, 0,15% -ва пептонна вода, буферно -казеіново-дріжджова середу.
Склад цих композицій наступний:
Калію дигідрофосфат 0,45 г
Динатрію гідрофосфат 5.34 г
Вода дистильована 1000 мол
Буферний гліцерино-сольовий розчин
Натрію хлорид 4,2 г
Дікалія гідрофосфат 3,1 г
Калію дигідрофосфат 1,0 г
Гліцерин нейтральний 300 мл
Вода дистильована 700 мл
Натрію хлорид 0,85% розчин 1000 мол
Гліцерин нейтральний 500 мл
Динатрію гідрофосфат 20% розчин 150 мл
Вода дистильована 100 мл
Пептон бактеріологічний 0,1 г
Натрію хлорид 0,5 г
Калію нітрат 0,1 г
Натріюбікарбонат 0,2 г
Гідролізат казеїну 2,0 г
Екстракт пекарських дріжджів 5,0 мл
Фосфатно-буферний розчин до 1000 мл
Так для транспортування ентеробактерій в якості консервантів рекомендується використовувати фізіологічний розчин, гліцериновий і фосфатно-буферний розчини. Інструкція з лабораторної діагностики кампілобактеріозу передбачає використання для цих цілей, крім фізіологічного розчину, 0,1% -ную пептонную воду (від 3 до 48 год.) Або тіогліколевую середу для контролю стерильності (до 3 діб).
Слід зазначити, що охолодження до 4 о С дозволяє значно подовжити терміни транспортування зразків на цих середовищах: в фізіологічному розчині - до 24 годин, в 0,1% пептонній воді - до 72 годин і на тиогликолевой середовищі для контролю стерильності - до 5 - 7 діб. При дослідженні матеріалу на наявність иерсиний гліцеринові консерванти не придатні. В цьому випадку досліджуваний матеріал зберігають при 4 - 8 о С 7 - 15 днів в фосфатно-буферному розчині або буферно-казеїново-дріжджовий середовищі.
Відомо кілька десятків середовищ, які потенційно можуть бути використані як транспортні. Однак більшість з них не відповідають одному з двох обов'язкових вимог, які і визначають придатність середовища саме як транспортной.Транспортная середовище, з одного боку, повинна забезпечувати збереження життєздатності мікроорганізму, причому не менше 8 - 12 годин при кімнатній температурі, і, в той же час, зобов'язана попередити або в значній мірі лімітувати розмноження мікроорганізмів.
Останнє особливо важливо. Необхідно зберегти життєздатність тієї частини патогенної мікрофлори, яка поза господаря швидко гине, особливо за умови конкурентного зростання менш вимогливих мікроорганізмів. Як уже відзначено, ця ситуація зустрічається дуже часто, якщо досліджується ранові відокремлюване, кишковий вміст, мокрота, мазки із зіву і деякі інші біосубстратами. Облігатно анаеробні бактерії, пневмококи, гемофільні бактерії, нейсерії і багато інших мікроорганізмів важко виділити з біоматеріалу, якщо паралельно йде процес інтенсивного розмноження сапрофітних бактерій або більш життєздатних хвороботворних мікроорганізмів. Крім того, загибель вимогливих бактерій визначається створенням несприятливих для них умов, таких як несприятливі рН, окисно-відновний потенціал, наявність або відсутність вільного кисню, а також дія антимікробних метаболітів, які при певних умовах можуть утворювати актіномецети, псевдомонади, ешерихії та інші містяться в зразку мікроорганізми.
Досвід створення і використання транспортних поживних середовищ великий і формально велика їх номенклатура. Однак фактично в світовій практиці стабільно використовують тільки дві транспортні середовища, які називають по прізвищах їх творців: середа Еймса і середовище Кері-Блейра, і які є найбільш універсальними транспортними середовищами для збереження переважної більшості видів бактерій. Середа Еймса призначена для широкого кола бактерій, середа Кері-Блейра для кишкових мікроорганізмів.
Середа Кері-Блейра була запропонована розробникам в 1954 році. За минулий тривалий період її рецептура фактично не змінювалася. Не викликало різночитань і призначення середовища - спочатку воно трактувалося як збереження мікроорганізмів при транспортуванні з акцентом на мікроорганізми кишечника.
Натрію хлорид 5,0 г
Динатрію гідрофосфат 1,1 г
Кальцію хлорид 0,1 г
Натрію тиогликолят 1,5 г
Вода дистильована до 1000 мл
Мікроорганізми кишечника різноманітні, вони включають представників резидентної і транзиторної мікрофлори. Остання в свою чергу може включати найрізноманітніші бактерії і гриби, в т.ч. сапрофітні. У той же час, практика мікробіологічних служб клінічних установ націлена на виділення певного кола мікроорганізмів кішчніка, перш за все представників сімейства ентеробактерій (шигели, сальмонели), рідше т.зв. неферментуючих грамнегативнихбактерій, кишкових коків і дріжджоподібних грибів.
Транспортне середовище Кері-Блейра попереджає загибель мікробних клітин, зберігає їх життєздатність, але при цьому перешкоджає розмноженню. Ці властивості середовища забезпечуються її компонентним складом. Низька поживна цінність і, перш за все, відсутність джерел азоту та вуглецю, як ключових елементів розвитку популяції, обмежує процеси росту і розмноження мікроорганізмів.
Процедура використання цього середовища полягає в наступному: розплавлену середу Кері-Блейра розливають в стерильні пробірки по 6 - 9 мл. Обсяг середовища в пробірках визначається технікою посіву. При посіві мазка, взятого тампоном на тампонодержателе, достатній невеликий стовпчик середовища - 6 мл. При прямому посіві біоматеріалу (без тампона) обсяг середовища в пробірці збільшують. У такому вигляді середу можна довго зберігати при температурі 2 - 8 о С.
Біологічний матеріал занурюють в стовпчик середовища таким чином, щоб він не залишався на її поверхні. Після цього пробірку з засіяної середовищем поміщають в контейнер і направляють в лабораторію.
Середа Кері-Блейра зберігає життєздатність вимогливих бактерій близько доби, після чого зазначають поступову загибель клітин. Тому пересівши з транспортної середовища на збагачені, диференційно-діагностичні чи інші поживні середовища необхідно проводити в максимально доступні терміни. Разом з тим, є дані про те, що сальмонели в цьому середовищі зберігають життєздатність кілька місяців.
Середа Еймса використовується як транспортна для широкого кола мікроорганізмів найрізноманітніших біологічних субстратів (гній, ранові відокремлюване, мокрота, спинномозковій рідині і ін.), Крім калу. Середа Еймса може бути з вугіллям і без нього:
Натрію хлорид 3,0 г
Динатрію гідрофосфат 1,05 г
Калію дигідрофосфат 0,2 г
Калію хлорид 0,2 г
Кальцію хлорид 0,1 г
Магнію хлорид 0,1 г
Натрію тиогликолят 1,0 г
(Як необов'язковий компонент) 10,0 г
Вода дистильована до 1000 мл
Вугілля додають в середу Еймса для сорбції мікробних метаболітів, негативно впливають на високочутливі патогенні мікроорганізми. Зокрема, це умова особливо важливо для збереження життєздатності гонококів.
Техніка посіву на середу Еймса така ж, як і на середу Кері-Блейра.
Суперечливо думку про придатність середовища Еймса для транспортування биосубстратов з облігатно-анаеробними бактеріями. Безумовно, наявність низького редокс-потенціалу, який забезпечується тіогліколятом натрію, а також стовпчик напіврідкого агару, в який занурюється біоматеріал, обмежують контакт мікроорганізмів з атмосферним киснем і надходження його в середу в розчиненому вигляді, що може сприяти збереженню життєздатності ряду видів облігатно-анаеробних бактерій (найбільш демонстративні в цьому відношенні клостридії). Однак середовище не забезпечить тривалого збереження тих облігатних анаеробів, які високо чутливі до кисню (наприклад, деяких видів бактероїдів).
Крім зазначених вище, є широкий перелік транспортних середовищ, які використовуються для транспортування певних видів мікроорганізмів. Найбільш суворі вимоги пред'являються до транспортування матеріалу, що підлягає бактеріологічному дослідженню на наявність неспорообразующих анаеробних мікроорганізмів. Ці бактерії швидко гинуть при контакті з киснем повітря, що змушує використовувати для транспортування матеріалу судини, заповнені інертним газом. Так, наприклад, добре відома рідка збагачення середовища під інертним газом з гемином і вітаміном К для прямого посіву крові і рідких биосубстратов. Вона служить одночасно транспортної середовищем і середовищем для культивування анаеробних бактерій, включаючи строгих анаеробів
Ряд цільових транспортних середовищ включає в себе антимікробні агенти (селективний компонент). Ці речовини пригнічують ріст супутньої мікрофлори, але не діють на шуканий мікроб. Інші компоненти середовища забезпечують його життєздатність. Прикладом може служити середовище для лістерій, яка одночасно є «голодної» і містить речовини селективного дії (дано на літр):
Натрію гліцерофосфат 10,0 г
Натрію тиогликолят 1,0 г
Кальцію хлорид 0,1 г
Налідіксова кислота 0,04 г
Значно більш «багатою» представляється середовище для транспортування кампілобактерій (т.зв. Кампі ТХІО середа), склад якої включає п'ять антимікробних препаратів (дано на літр):
Панкреатичний перевар казеїну 20,0 г
Натрію хлорид 2,5 г
Дікалія гідрофосфат 1,5 г
Натрію тиогликолят 0,5 г
Натрій серністокіслий 0,2 г
Цефалотин 0,02 г
Ванкоміцин 0,02 г
Амфотерицин В 0002 р
Триметоприм 0,002 г
Поліміксин В 3000 ЕД
Наведена пропис мало чим відрізняється від складу інших поживних середовищ для кампілобактерій (см.заключітельную главу). Очевидно, що розробники середовища зробили акцент, в першу чергу, на селекціонують дії антибіотиків, зберігши, в цілому, склад середовища, достатній для підтримки життєздатності багатьох мікроорганізмів.
Такий же принцип використаний в транспортному середовищі для хламідій. Крім того, в ній враховано можливість застосування для селекції осмотичного фактора (дано на літр).
Дікалія гідрофосфат 2,1 г
Калію дигідрофосфат 1,1 г
Сироватка крові великої
рогатої худоби 50,0 мл
Ванкоміцин 0,1 г
Стрептоміцин 0,05 г
Ністатин 25000 ОД
Антибіотики і сироватку асептично вводять в стерильну живильне середовище перед її розлиттям у флакони і пробірки.
Існує ряд досить складних за складом транспортних поживних середовищ для нейссерий, мікоплазм і їх поєднань переважно в биосубстратах, отриманих з сечостатевого тракту. Деякі варіанти розглядаються як транспортні середовища для вимогливих бактерій в цілому, але особливо для нейссерий. Пропис однієї з них, що належить до великої групи т.зв. Transgrow Medium, наведена далі (дано на літр).
Гемоглобін 10,0 г
Панкреатичний перевар казеїну 7,5 г
Натрію хлорид 5,0 г
Кукурудзяний крохмаль 1,5 г
Дікалія гідрофосфат 4,0 г
Калію дигідрофосфат 1,0 г
Вітамін В12 0,001 г
Тіамін пірофосфат 0,001 г
П-Амінобензойна кислота 0,0002 г
Антибіотична добавка 10,0 мл
Антибіотична добавка включає ряд антибіотиків, покликаних надати середовищі селективні властивості. Є ряд пропозицій, жодне з яких в повній мірі, природно, не може забезпечити гарантоване придушення зростання супутніх мікроорганізмів. У різних джерелах найбільш часто згадують наступний склад (на літр середовища додають 10 мл розчину антибіотиків).
Поліміксин В 0,0075 г
Ванкоміцин 0,0035 г
Триметоприм 0,0035 г
Ністатин 12500 ОД
ГЛАВА 8.ПІТАТЕЛЬНИЕ СЕРЕДОВИЩА ДЛЯ ВИДІЛЕННЯ І ІДЕНТИФІКАЦІЇ ентеробактерій
Серед збудників захворювань людини ентеробактерії відносяться до числа відносно невимогливих мікроорганізмів. Вони здатні давати зростання на різних базових поживних середовищах, що використовуються в мікробіологічних дослідженнях. Однак сімейство Enterobacteriaceae досить широко; воно об'єднує різні за своїми властивостями бактерії. Крім того, ті області людського тіла, де багато представників сімейства є об'єктом природного проживання або паразитування, рясно населені резидентної мікрофлорою. Ось чому поживні середовища, які використовуються при роботі з ентеробактеріями, в першу чергу вирішують завдання їх селективного виділення і бактеріологічної діагностики. Це характерно як для вітчизняної, так і зарубіжної практики.
Згідно багатьом вітчизняним методичним рекомендаціям і вказівкам, в тому числі схвалених Міністерством охорони здоров'я, як обов'язкові при бакдіагностіке ентеробактерій запропоновано використовувати середовища збагачення, середовища для селективного виділення і диференціації. Їх перелік наведено в таблиці. Названо ті середовища, які освоєні вітчизняними виробниками, а також ті з них, чиє впровадження в мікробіологічну практику визнано перспективним.
Вітчизняні рекомендації в принциповому плані мало відрізняються від щоденної практики застосування поживних середовищ за кордоном. Живильні середовища для ентеробактерій сконструйовані таким чином, щоб використовувати ростові особливості окремих родів і видів і їх здатність конвертувати той чи інший субстрат. У наступній таблиці 7 вибірково узагальнені ті властивості ентеробактерій, які враховані і успішно реалізовані в поживних середовищах для диференціації мікроорганізмів цього сімейства.
транспортні середовища - Еймса, або Кері-Блейра, або Стюарта;
базові середовища - кров'яний агар, агар на переварити сої (tryptic soy agar);
селективні і диференційно-діагностичні середовища - ацетатний агар, пептонна вода з реактивом Андреде, середа Кліглера, агар МакКонкі, рідке середовище для визначення уреази і освіти індолу, середа з дезоксихолатом і цитратом, SS-агар (як альтернатива середовища з дезоксихолатом), цитратний агар Сіммонса. До цієї ж групи поживних середовищ може бути віднесений названий в переліку brolacin agar, більш відомий в Росії, як CLED-агар, що випускається НВО «Живильні середовища», г.Махачкала (середовище, що містить цистин, лактозу і індикатор і дозована по електролітного складу) . Хоча, строго кажучи, це середовище призначена для виділення не тільки ентеробактерій.
Слід нагадати ще один закордонний досвід.
У практиці роботи мікробіологів США при виділенні ентеробактерій з кишкового вмісту запропоновано використовувати такі групи поживних середовищ.
Як транспортну - середу Кері-Блейра.
Диференційно-діагностичні. агар МакКонкі і ЕМВ-агар (з еозином і метиленовим блакитним).
Помірно селективні. гектоен-ентеро агар, SS-агар (шигелла-сальмонела агар), XLD-агар (з ксилозой, лізин і дезоксихолатом).
Високо-селективні середовища: агар з діамантовим зеленим і вісмут-сульфіт агар.
Природно, що все перераховане не виключає застосування базових поживних середовищ, перш за все поживного агару з додаванням баранячих еритроцитів.
Призначення транспортної середовища очевидно. Друга група середовищ дозволяє віддиференціювати культури, ферментують лактозу, від лактозонегативних. Наступна (помірно селективна середа) забезпечує зростання сальмонел і шигел, в той час як зростання інших ентеробактерій частково або повністю пригнічується. Остання група призначена для виділення сальмонел, але зростання шигелл на них не гарантований.