Для отримання чистих культур грибів - факультативних сапрофітів і факультативних паразитів, підтримки їх життєздатності в цілях подальшого вивчення застосовують різні поживні середовища. Ці середовища розмежовують на тверді і рідкі з відомим і невідомим хімічним складом, природні і штучно приготовлені. Вибір того чи іншого типу поживного субстрату залежить від потреб грибного організму і цілей дослідження, що проводиться. Наприклад, при вивченні імунітету рослин для оцінки стійкості рослини-господаря до токсичних речовин збудника хвороби і впливу його виділення на ріст патогенних форм необхідне отримання рясного спороношения.
Специфічні середовища відбирають у процесі експериментальних робіт. Гриб висівають одночасно на різні середовища в центрі чашок Петрі (в трьох повторностях) і витримують при оптимальних для його розвитку температурах. Спостереження проводять протягом 12-15 діб над зростанням і розвитком гриба (енергія зростання, початок і характер спороношения, густота міцелію і т. П.), В результаті вибирають найбільш сприятливе середовище. При використанні стандартних синтетичних середовищ їх склад можна змінювати, додаючи і виключаючи різні хімічні компоненти.
Часто виникає необхідність вишукувати середовища, па яких би гриб ріс і розвивався краще, ніж в природі. Цього можна досягти завдяки тому, що після стерилізації в середовищі знищуються конкуруючі мікроорганізми, а складові речовини її зазнають глибокі біохімічні зміни, що сприяють кращому засвоєнню деякими грибами. Зазвичай це агарові середовища з відваром або настоями (витяжками) з рослини-господаря або стебел буркуну. Так, па 1 л води беруть 100 г свіжих або 50 г висушених органів живлять гриб рослин. Масу подрібнюють, кип'ятять одну годину, відновлюють первинний об'єм рідини, фільтрують, після чого додають 2-2,5% агар-агар, розчиняють його і стерилізують (М. К. Хохряков, 1969).
І. І. Міікевічем при вирощуванні грибів, які паразитують на деревних рослинах, були використані природні поживні середовища, приготовані за таким рецептом. Дрібно нарізані гілки певних деревних порід (200 г) заливали водою (1 л) і витримували протягом 12 год при 80 ° С, після чого настій фільтрували і додавали агар-агар (2,5%). Потім середу стерилізували два години текучим паром в апараті Коха. При спеціальних дослідженнях з різних сортів готували витяжки, які вирівнювали по концентрації (1% по сухій речовині) шляхом послідовного розведення. Можливе застосування подібних природних середовищ і в більш високій концентрації.
Для певних систематичних груп патогенних грибів багатьма дослідниками були підібрані природні поживні субстрати і визначені середовища з відомим хімічним складом. Так, досвідченим шляхом встановлено, що види роду Fusarium добре ростуть на відварених зернах рису; гриби роду Piricularia розвивають рясне спороношення на агарної середовищі з відваром пшеничних зерен або коренеплодів моркви. Склади твердих поживних середовищ для окремих видів і груп грибів наведені в таблиці 20.
Готуючи середовища, треба мати на увазі наступні обставини:
- гриби зазвичай ростуть краще на середовищі, багатої вуглеводами, але вирощування їх на таких середовищах тривалий час може редукувати споруляцшо;
- більшість грибів краще слабокислу реакцію (рН 6,0-6,5), а бактерії - нейтральну (рН 7,0) або слаболужну;
- вуглеводи і білки в кислих і лужних розчинах руйнуються при нагріванні, тому вони повинні бути помірно стерилізовані або додані окремо;
- агар розчиняють у половинній нормі води протягом 1-2 год, а поживні речовини - в воді, що залишилася, після чого компоненти змішують;
- агар НЕ твердне в дуже кислих або лужних середовищах;
- пептони в основному може бути виключений зі складу середовищ, що призначаються для грибів;
- кип'ячену воду слід віддати перевагу дистильованої, оскільки перша містить корисні мікроелементи; для грибів роду Phytophthora краще використовувати дистильовану воду;
- для середовищ, до складу яких входить рослинний матеріал, з нього попередньо роблять витяжку при низьких (картопляний агар) або високих (картопляно-декстрозних агар) температурах.
У ряді випадків (при вивченні токсичних виділень патогенів, ферментів і т. Д.) Вживають рідкі поживні середовища. Наприклад, токсична дія виділень Deuterophomatracheiphila вивчалося на середовищі, приготовленої, настоюванням намельченних пагонів рослини-господаря (200 г пагонів на 100 см 3 води). Для сажкових грибів рекомендована середи наступного складу: 0,03 г K2 S04; 0,01 г NH4 NO3; 10,0 г глюкози (або мальтози); 0,01 г CaCl2; 0,01 г Mga (Р04) 2 -4Н2 0 і води 100 см 3.
Для проведення різних досліджень з біології грибів та стійкості рослин виникає необхідність тривалого зберігання чистих культур. Однак після зберігання ряд патогенних грибів змінює морфологічні та культуральні ознаки, а іноді втрачає патогенні властивості. Тому перед проведенням дослідів з грибами, взятими після тривалого зберігання в чистій культурі, необхідно відновити їх патогенність, проводячи. пасажі через рослина-господаря.
Склад поживних середовищ для вирощування фітопатогенних грибів
Назва живильного середовища
Склад компонентів на 1 л води, г
Широко поширеним способом підтримки чистих культур грибів служать періодичні пересівання їх на свіжі поживні середовища. Більшість культур пересівають 2-3 рази на рік. При пересіву переносять головним чином спори, а у неспорообразующих форм -міцелій з крайової зони колонії.
Пересівання роблять в двох повторах, а на зберігання залишають 3 примірника кожної грибний культури, вважаючи і пересівши попереднього терміну. Один з нових пересівань використовують тільки для майбутнього пересіву, інший - для відсіву при проведенні експериментальних робіт.
Для тривалого зберігання грибів краще використовувати бідні цукрами крохмальні і целюлозні середовища. Ряд полусапрофітних грибів добре зберігається на стерильному природному матеріалі (наприклад, гриби роду Cytospora па гілках рослини-господаря); при цьому найбільше підходить температура 4-5 ° С. Глибоке охолодження (приблизно близько - 20 ° С) задовільно зберігає життєздатність грибів досить тривалий період.
Зберігати культури грибів можна також під мінеральним маслом, після ліофілізації (висушування виморожуванням при зниженому тиску) і під рідким азотом в ампулах. Якщо гриби витримують повну обробку, то вони будуть життєздатні 10 років і більше. Однак використання цих методів вимагає громіздкої і дорогої апаратури.
У звичайних умовах колекцію грибів краще всього містити в широких пробірках на косою живильному середовищі, закритих ватними пробками. Однак слід остерігатися псування культур кліщиками (види пологів Tyroglyphus і Tarsonemus), особливо в південних районах і влітку в помірному кліматі. Пробираючись в пробірку, колби і чашки Петрі, вони поїдають культури, заражають їх бактеріями і забруднюють.
Є численні способи боротьби з цими кліщиками. Але перш за все необхідно дотримуватися загальної гігієни, вживати заходів до того, щоб в лабораторії не залітали комахи, бути уважним при роботі з органічним матеріалом і з грунтом. Весь новий матеріал під час вступу підлягає ретельній перевірці. По можливості слід мати окремі кімнати для чистого і брудного матеріалу.
Досить щільні ватні пробки зазвичай непроникні для кліщиків, причому повітропостачання культури не порушується. Для більшої гарантії пробки можуть бути оброблені отрутами, згубно діють тільки на кліщиків. Рекомендується також використання цигаркового папір. З цією метою після закупорки ободок .ватной пробки обпалюють у полум'ї пальника і покривають його липким теплим желатином з сульфатом міді (сульфат міді - 20%, желатин - 20%, вода - 60%). Потім закріплюють це покриття над кінцем пробірки цигарковим папером. Після підсихання зайву папір обпалюють. Такий папір сочень тонкими порами перешкоджає проникненню кліщиків, забезпечуючи доступ повітря. Таким же способом можна закупорювати колби, але при цьому гумові пробки повинні бути видалені, а цигарковий папір перед використанням простерилізована.
Корисно також всі колби, чашки і пробірки з зараженим матеріалом закривати при отриманні папером.
Всі культури повинні бути пронумеровані і зареєстровані на спеціальних картках, в які записують номер і назва культури, де і звідки вона виділена, дату виділення, спосіб виділення, назва середовищ, застосованих при пересіву, результати спостережень за ростом патогена в чистій культурі і відмічені при цьому особливості.