40-річний Еціо Аудиторові та Фіренце піднявся на вершини ієрархії ордена після закінчення подій гри Assassin's Creed II. Помстившись убивцям батька і братів, він покинув Рим і насолоджується життям на своїй віллі. Дія гри починається в 1499 році, коли Еціо після розмови з Мінервою біжить з Риму разом зі своїм дядьком Маріо Аудиторові. Потім тосканський місто, де знаходилася вілла Аудиторові - Монтеріджоні (Monteriggioni) обложена величезною армією Папської області, посиленою французькими загонами. Облогу проводить син Родріго - Чезаре Борджіа. Гармати Борджіа руйнують місто, а Чезаре на очах у Еціо вбиває дядька Маріо. Провівши уцілілих жителів Монтеріджіоні по катакомбах, Еціо вирішує помститися Чезаре і відправляється в Рим. По дорозі Еціо непритомніє, так як під час бою йому прострелили плече.
Дія гри переноситься в 1500 рік, де Еціо змушений організувати і почати розвивати «підпілля» (до якого входять Римські злодії, найманці, куртизанки, а далі і рекрути-ассасини), коли починає відроджуватися орден, лідером якого формально був Ніколло Макіавеллі, який після передає титул Еціо. Протягом гри Еціо намагається знайти вбивць своїх родичів і помститися їм, а також повернути Риму колишньої світ, порядок і процвітання.
В майбутньому Дезмонд, Люсі, Шон і Ребекка прибувають в Монтеріджоні. Вони влаштовують укриття в Святилище під віллою Аудиторові, щоб тамплієри не змогли виявити їх, і продовжують пошуки Яблука Едему, щоб зупинити катастрофу, що насувається.
Сам же Еціо за допомогою Бартоломео, Ла Вольпе і Клаудії дізнається що Яблуко Едему було передано на вивчення вченому, Катерина Сфорца буде в замку Сант-Анджело на наступному тижні, а Чезаре в замку з Папою. Крім того, Ла Вольпе повідомляє, що Макіавеллі - зрадник і навіть показує його зустріч з солдатами Борджіа. Але, довіряючи Макіавеллі, Еціо просить Ла Вольпе не робити поспішних висновків. Після Еціо проникає в замок і рятує Катерину, але не встигає дістатися до Чезаре. Нарешті, Еціо вирішує відтворити Братство Асасинів. Того ж вечора з Еціо зустрічається Леонардо Да Вінчі, після чого Леонардо заново створює втрачене озброєння Еціо. Виявилося, що вченим, якому передали яблуко, був сам Леонардо, але Родріго забрав його. Да Вінчі також повідомляє про всі плани і його будівлях для армії Чезаре, які Еціо доведеться знищити.
За допомогою сенатора, який відвідує бордель Марії, Еціо дізнається, де знаходиться кардинал Хуан Борджіа, він же Банкір. З його смертю Чезаре позбавляється коштів на війну. Потім Еціо і Бартоломео проникають в табір французів і вбивають барона Де Валуа. Нарешті, Еціо рятує життя акторові П'єтро, який в таємниці від Чезаре зустрічається з Лукрецией. Довідатися Чезаре наказав Мікілетто отруїти його, Еціо нейтралізує Мікілетто, але не вбиває його і рятує актора, а натомість отримує ключ від запасного входу в замок Сант-Анджело. Того ж вечора Еціо зустрічає злодія з пов'язкою на правому оці, того самого який брав участь під час битви за Монтеріджоні. З'ясовується, що зрадник - він, а не Макіавеллі. Еціо вбиває зрадника і знаходить Ла Вольпе, який вже майже збирається вбити Макіавеллі, і повідомляє про те, що дізнався, надавши лист, яке він взяв у злодія.
Потрапивши в замок, Еціо вирішує вбити Чезаре, але той, дізнавшись, що Родріго хотів отруїти його, вбиває його і за допомогою тортур дізнається розташування Яблука від Лукреції. Лукреція, бажаючи помститися Чезаре, розповідає Еціо, де Яблуко. Еціо випереджає Чезаре, і знайшовши Яблуко, вирішує раз і на завжди покінчити з Чезаре. Спочатку він знищує все війська Чезаре в Римі, потім засмучує зустріч Чезаре з кардиналами, щоб він не попросив у них допомоги. Нарешті, через рік Еціо назавжди позбувається Чезаре, коли його заарештовують солдати під звинуваченням у зраді і вбивстві.