фарбування мікропрепаратів
Більшість фарб, застосовуваних в мікробіології, належать до похідних бензолу і добуваються з кам'яновугільної смоли.
Барвники застосовуються в мікробіології, є солями двох типів: 1) кислі барвники - це ті, у яких іон, що надає забарвлення (хромофор), є аніоном (прикладом може служити еозин); 2) основні барвники - ті, у яких роль хромофора грає катіон (прикладом може служити метиленовийсиній).
Барвники першого типу є кислими тому, що хромофор, будучи кислотою, при утворенні надає забарвлення солі, зв'язується з основою (NaOH).
Барвники другого типу називаються основними тому, що хромофор, будучи підставою, при утворенні солі зв'язується з кислотою (HCl) /
Як правило, кислі барвники зв'язуються більш інтенсивно з цитоплазмових (основними) компонентами клітини, а основні - з ядерними (кислими).
Дія деяких барвників не залежить від освіти солей або інших хімічних сполук з забарвлюваним матеріалом. Вони просто покривають поверхню, адсорбируясь, розчиняючись або осідаючи в матеріалі.
У процесі фарбування грають роль як фізичні, так і хімічні чинники
Існують прості і складні методи фарбування мікропрепаратів.
Прості методи забарвлення
Для простого методу фарбування мікропрепаратів найчастіше користуються основними аніліновими барвниками. Дуже широко застосовують метиловий синій, основний фуксин, кристалічний фіолетовий, метіонін.
Простий метод фарбування може бути застосований як для фарбування убитих мікробних клітин в фіксованих мікропрепаратах, так і для прижиттєвої забарвлення мікроорганізмів.
Прижиттєвої забарвленням слід вважати лише таку, при якій пофарбовані організми тривалий час залишаються живими і здатними до розмноження. Існує кілька способів прижиттєвої забарвлення, в тому числі і спосіб Nakanischi.
При цьому способі чисте предметне скло обливають насиченим водним розчином метиленової сині, висушую і обтирають сухою ганчіркою до тих пір, поки наліт фарби не прийме світло - блакитного відтінку. На покривному склі готують мазок з досліджуваних мікробів, після чого не висохлий до кінця препарат накладають на предметне скло з барвником. За допомогою мікроскопа можна спостерігати, як мікроби, залишаючись живими, не втрачаючи своєї активної рухливості (якщо такий володіють), поступово забарвлюються в синій колір.
Цей метод цінний тим, що при його застосуванні відсутня небезпека утворення штучних продуктів обробки, в можливості виявлення деяких функціональних особливостей мікробної клітини.
Серед простих методів забарвлення існують як позитивні, так і негативні способи фарбування.
До простих позитивним методам забарвлення відноситься забарвлення за методом Лнеффлера, а до негативних - фарбування за методом Бурі.
Для забарвлення за методом Леффлера (Loffler) можна застосувати розчин метиленового синього (барвник Леффлера), який дозволяє виявити багато деталей форми і структури мікроорганізмів. Барвник Леффлера є сумішшю двох розчинів А і Б.
Розчин А: метиловий синій - 0,3г, етиловий спирт - 30,0мл.
Розчин Б: КОН (0,01%) - 100мл.
Суміш добре зберігається у флаконі з притертою скляною пробкою.
Для отримання більш чистих препаратів, фарбу можна наливати на мазок покритий фільтрувальної папером, або використовувати фільтрувальну папір заздалегідь просочену барвником і висушену. В такому випадку на фіксований мазок накладають смужку сухий просоченої красілелем фільтрувального паперу, а потім на папір піпеткою наносять декілька дистильованої води і пінцетом або шпателем притискають фільтрувальний папір до скла. Барвник вимивається з паперу та забарвлює мазок. Після закінчення часу фарбування, фільтрувальну папір знімають, препарат промивають обережно струменем води, висушують і проводять мікроскопію.
В правильно пофарбованому і добре промиті препараті поле зору залишається світлим і чистим, а пофарбованими будуть тільки мікробні клітини.
Крім позитивних способів забарвлення в деяких випадках застосовуються негативні (контрастні) способи. В цьому випадку мікроорганізми, в які барвник не проникає, виглядають як світлі частинки на рівномірно пофарбованому тлі.
Дуже часто для негативного фарбування мікропрепаратів користуються рідкої чорною тушшю ( «негативний спосіб» Burri).
За способом Бурі фон препарату заливають рідкою тушшю. Туш не є істинним барвником, тому тіла мікробів залишаються незабарвленими; внаслідок чого виходить ніби негативний їх зображення.
При цьому способі туш розбавляють водою в співвідношенні 1: 9, 1: 1 або 1: 2.
Оскільки туш сама по собі може містити бактерії, її стерилізують, додаючи кілька крапель формаліну або автоклавують 30 хвилин при 110 градусах. Перед вживанням підготовлена туш (розбавлена і стерильна) повинна протягом двох - трьох тижнів зберігатися в спокійному стані, щоб осіли зважені в ній частки. При приготуванні тушевие препаратів використовується верхня частина відстояною рідини.
Краплю чорної туші наносять на предметне скло і ретельно змішують з краплею мікробної суспензії. Суміш тонким шаром розмазую по поверхні предметного скла краєм покривного скельця. Коли темний шар висохне, препарат фіксують і досліджують за допомогою мікроскопа. Мікробні клітини видно у вигляді безбарвних тілець а темному тлі препарату.
Крім рідкої туші для негативного фарбування можна використовувати водні розчини конгорот (3% 0, нігрозину (10%) і деяких інших барвників. Фарбування негативними барвниками можна проводити двома способами: або розчин барвника наносити на сухий фіксований мазок, після промивання водою і висушування микроскопировать; або краплю досліджуваної суспензії мікробів змішують з барвником, накривають покривним склом і проводять мікроскопію. і в тому, і в іншому випадку мікробні клітини будуть безбарвними.
Складні методи забарвлення
Простий метод позитивного або негативного способу забарвлення мікроорганізмів дуже зручний для найрізноманітніших цілей (вивчення форми і розташування клітин, визначення розмірів, виявлення капсул у мікробних клітин в мазках - відбитках з органів інфікованого організму та ін.).
Однак простий метод забарвлення не дозволяє диференціювати мікроорганізми (в тому числі і бактерії) подібні за формою і розмірами, але належать до різних видів, простий метод забарвлення не дозволяє виявити зрілі суперечки і цисти, висипалися з клітки в навколишнє середовище, простий метод забарвлення не дозволяє виявити клітини зі складною структурою оболонки тощо.
В силу цього велику цінність представляють складні методи забарвлення, що дозволяють отримати уявлення не тільки про форму, розміри, розташування клітин один щодо одного, по дозволяють диференціювати мікроби і визначати структурні деталі мікробних клітин.
Серед складних методів забарвлення велику цінність представляє спосіб забарвлення розроблений данським ученим Грамом, що дозволяє диференціювати мікроорганізми на дві великі групи, звані «грампозитивними» і «грамнегативними», що має велике значення при ідентифікації мікроорганізмів.
Цей спосіб забарвлення називають диференціальної забарвленням. В основі диференціації мікробів по граму лежить властивість клітинної оболонки і цитоплазматичної мембрани.
Основою клітинної стінки грампозитивних і грамнегативних мікроорганізмів є пептидогликан. У грампозитивних мікробів пептидогликан має кілька шарів, у грамнегативних - він однослоен.
У грампозитивних мікробів, що володіють щільним і багатошаровим пептідогліканов, що утворився комплекс при фарбуванні кристалічним фіолетовим та подальшій обробці йодним розчином вимивається спиртом, і клітини не знебарвлюються і зберігають фіолетовий колір. У той час як грамнегативні мікроби, маючи тонкий шар пептидоглікану, знебарвлюються спиртом. При додаткової забарвленням фуксином або сапраніном грамнегативні клітини фарбуються в бузково - червоний колір.
Мікроорганізми, які зберігають забарвлення, називаються «грампозитивними» і позначаються «Г +», а знебарвлені - «грамнегативними» і позначаються «Г».
Показники диференціації грампозитивних і грам негативних мікро:
Грампозитивні мікроорганізми не чутливі до дії шлункового соку, мають не складну структуру. Резистентні до лугів, чутливі до лізоциму, пеніциліну, йоду. Імуногенні властивості виражені слабо, оптимум зростання при відносно високому рН. У живому стані більш проникні для барвників, чутливі до електролітів. Можуть бути кислотостійкими і можуть утворювати спори. Мають багатошаровий пептидогликан і можуть містити тейхоевие кислоти. Клітинна стінка пориста, містить мало білків, пептиди за складом амінокислот одноманітні. Ліпідів мало, багато гликопротеидов (99%).
Грамнегативнімікроорганізми в більшості випадків розчиняються під дією шлункового соку, розчиняються в 1% розчині КОН, чутливі до кислот. Малочутливі до лізоциму, пеніциліну, йоду. Добре виражені імуногенні властивості. Оптимум зростання при низькому рН середовища. У живому стані погано проникні для анілінових барвників. Резистентні до слабких електролітів, спор не утворюють. Основою клітинної стінки є одношаровий пептидогликан, тейхоєва кислота відсутня. Клітинна стінка малопорістое, має складну структуру, містить всі амінокислоти. Ліпідів багато (до 22%), глікопротеїдів мало (5 - 9%).
Розчини для забарвлення за методом Грамма:
1. Розчин А - кристалічний фіолетовий - 2,0г, етиловий спирт 95% - 20,0мл.
2. Розчин Б - щавлевокислий амоній - 0,8 г, дистильована вода - 80,0 мл.
Розчин А розводять дистильованою водою (1: 5) і потім змішують його з рівним об'ємом розчину Б.
3. Розчин Люголя - йод кристалічний - 1г, йодистий калій - 2,5 г, дистильована вода - 80,0мл. Цю суміш залишають на 24 години для розчинення йоду.
4. Розчин для додаткової забарвлення - сапранін або фуксин (2,5% розчин в 95% спирті) - 25 мл. Дистильована вода - 75мл.
Методика забарвлення за методом Грамма:
1. Фіксований мазок, що містить мікробні клітини, пофарбувати генціанвіолетом (2 хвилини).
2. Злити генціанвіолет, після чого нанести на препарат розчин Люголя (2 хвилини).
3. Обережно злити розчин Люголя і промити препарат 95% етиловим спиртом (30 секунд. Клітини з багатошаровим пептідогліканов залишаться пофарбованими генціанвіолетом, з одношаровим пептідогліканов - знебарвиться).
4. Препарат обережно промити струменем води.
5. Мазок забарвити розчином фуксину або сапраніна (1 - 2 хвилини).
6. Препарат обережно промити струменем води, висушити на повітрі при кімнатній температурі або в потоці теплого повітря над полум'ям пальника, або обережно промокнути фільтрувальної папером.
7. Препарат досліджувати за допомогою мікроскопа.
До складних диференційно - діагностичних методів забарвлення відноситься також і забарвлення за методом Ціль - Нільсена (Ziehl - Naelsen), що дозволяє відрізнити кислотостійкі мікроорганізми від інших, що не володіють цією властивістю.
Приготування і забарвлення мікопрепарата по Ціль - Нільсеном проводиться наступним чином:
1. Готують звичайним способом фіксований мазок з досліджуваного матеріалу (мокротиння хворого або чиста культура).
2. На фіксований мазок кладуть фільтрувальний папір і на неї наливають розчин карболового фуксину. Предметне скло затискають в пінцет Корне і препарат протягом 4-х хвилин нагрівають над полум'ям пальника (у міру випаровування рідини розчин барвника додається).
3. Через 4 хвилини (по закінченню прогрівання) фільтрувальну папір обережно знімають з препарату і на мазок на 30 секунд наноситься 5 - 10% розчин сірчаної або соляної кислоти приготований на 95% етиловому спирті.
4. Через 30 секунд препарат обережно промивають струменем холодної води і додатково дофарбовують розчином метиленової сині.
Механізм забарвлення кислотостійких мікроорганізмів по Ціль - Нільсеном можна пояснити наступним чином: під час нагрівання препарату віск, що входить до складу оболонки, розм'якшується, і завдяки цьому барвник проникає в бактеріальну клітину. Остигаючи, цей віск утримує барвник, тому спирт, з кислотою вимивають барвник тільки з клітин, що не володіють кислотоустойчивостью. При додаткової фарбуванні метиленовим синім фарбуються знебарвлені клітини і на цьому синьому тлі будуть чітко видні кислотостійкі бактерії, пофарбовані в червоний колір.
Розчини для забарвлення по Ціль - Нільсеном:
1. Розчин А - основний фуксин - 0,3г, етілдовий спирт 95% - 10,0мл.
2. Розчин Б - фенол (розплавлені кристали) - 5,0г, дистильована вода - 95, про мл.
3. Розчин метилової сині Леффлера або зеленки.
Розчини А і Б змішують (карболовий фуксин). Суміш добре зберігається.
У мікроскопічної практиці при вивченні мазків - відбитків з органів, мазки з крові, при вивченні спирохет, найпростіших, хламідій, культур тканин широко застосовується ще один складний метод забарвлення - забарвлення за Романовським - Гімза.
Методика забарвлення за Романовським - Гімза:
1. Препарат висушується, фіксується в рідкому фиксаторе (метанол 3 - 5 хвилин).
2. Препарат висушують і поміщають в стаканчик з робочим розчином барвника (експозиція 20 25 хвилин при 37 градусах. Концентрація розчину фарби і експозиція повинні бути титрувати). Перефарбований мазок диференціюється етиловим спиртом (50 - 60 градусним), споліскується обережно водою, висушується і проводять мікроскопію.
Розчини барвників для фарбування за Романовським - Гімза:
1. Варіант А. Готують розчин - 3,8г сухої фарби, що складається з суміші еозину і метиленової сині, розчиняють в 250 мл чистого метилового або етилового спирту. Розчин залишають на кілька днів, часто збовтуючи для кращого розчинення фарби. Потім додають 250 мл чистого гліцерину і залишають на 3 - 5 днів часто збовтуючи. Отриманий розчин - фарба Романовського - Гімза.
Перед вживанням фарбу оттітровивают в розведеннях 1: 1, 1: 2, 1: 3 і т.д. приготованих на дистильованої воді протягом 20 - 25 хвилин.
2. Варіант Б. Застосовують забарвлення АЗУР - еозином.
а) 1 г сухої фарби Романовського - Гімза (АЗУР і метиленовая синь) розчиняють в одному літрі дистильованої води.
б) 1 г еозину розчиняють в одному літрі дистильованої води.
Ці два розчину зберігають окремо в темному місці в скляних ємностях з притертими пробками.
Для фарбування препаратів ex tempore готують робочий розчин:
10 мл дистильованої води
4 мл розчину еозину
8 мл розчину фарби Романовського
Необхідною умовою для отримання хорошого забарвлення препаратів є якість води (рН води має бути нейтральним).