Пошук нових методів лікування раку залишається актуальним, так як більшість злоякісних пухлин резистентних до існуючих методів.
Тому зростає інтерес до нових методів прицільної (таргетной) терапії.
Під генною терапією розуміють перенесення генетичного матеріалу з лікувальною метою в клітку, тканину або орган, де цей матеріал починає експресувати специфічний генний продукт.
Досягнення в області рекомбінантної ДНК-технології дозволяють по-новому поглянути на зростання людських клітин, механізми його регуляції і його порушення при пухлинному процесі.
Для успішної генної терапії необхідно наступне:
- ідентифікувати та ізолювати функціонуючий ген, який після введення в клітину, тканину або орган усуне генетичне порушення;
- розробити метод доставки гена в клітину;
- вміти управляти експресією введеного гена.
Незважаючи на те що в світі виконано понад 600 клінічних
досліджень з генної терапії, більшість їх представляє лише фази I і II клінічних випробувань. В даний час ще немає офіційно дозволеної для клінічного застосування методики генної терапії. У Сполученому Королівстві ця проблема знаходиться у веденні Консультативного комітету з генної терапії. Як і в разі інших нових методів лікування, генну терапію поки пробують у хворих з далеко зайшла стадією раку. Однак в майбутньому, мабуть, її роль буде особливо значна при лікуванні раку на ранній стадії або після хірургічного видалення пухлини (тобто її застосовуватимуть в якості ад'ювантної терапії).
Розробляються в даний час методи в області генної терапії частково застосовують також в імунотерапії раку, що зближує ці два напрямки в одне - імуногенетика раку.
Імунотерапія заснована на впливі на імунологічні механізми розвитку злоякісної пухлини. Це дія направлена як на підвищення активного імунітету, так і на створення пасивного за допомогою біологічних препаратів.
Імунотерапія може бути двох видів:
- неспецифічної;
- специфічної - з допомогою препаратів, що зв'язуються з пухлинними антигенами.
Ідея створення протиракової вакцини не нова. Вона вперше виникла в період, коли була доведена роль інфекційного початку в розвитку деяких пухлин:
- Влч - раку шийки матки;
- HBV - печінково-клітинного раку;
- ВЕБ - лімфоми Беркітта і раку носоглотки.
Потім було висловлено припущення про те, що за допомогою вакцин проти специфічних пухлинних антигенів, мабуть, можна лікувати і пухлини, інфекційна природа яких не доведена. Перевагою такого методу лікування була б можливість генерації специфічної імунної відповіді після впровадження генного фактора, який би піддався ампліфікації і подальшої дисемінації, впливаючи на пухлинні клітини у віддалених частинах тіла. У більшості сучасних «проходжень по генної терапії використовують иммуногенетические методи.
Підходи до генної терапії раку
Соматична корекція генного дефекту:
- експресія гена-супресора пухлинного росту;
- переривання експресії мугантного онкогена антисмислового олигонуклеотидами.
Генетична активація пролекарства.
- неспецифічна імунотерапія;
- специфічна імунотерапія.
Соматична корекція генного дефекту
Експресія гена-супресора пухлинного росту
Гени-супресори пухлинного росту в процесі канцерогенезу втрачають свої функції. Повна втрата функції придушення, яка ініціює пухлинний ріст або сприяє прогресуванню пухлини, відбувається лише при інактивації обох алелей гена. Наприклад, ген р53 кодує ядерний білок, який діє як фактор транскрипції, блокуючи прогресію пухлини. Приблизно в 50% випадків раку у людини в пухлинних клітинах виявляють мутантний білок р53, який втратив свої функції. Мутації можуть бути спадковими і набутими. До генам-супрессорам пухлинного росту відносять також гени Rb1 (ретинобластома) і E-cadherin.
В експериментах на моделях пухлин в умовах in vivo заміна мутантного гена-супресора пухлинного росту нормальними копіями генів за допомогою вірусних векторів призводить до пригнічення росту пухлини і відновленню нормального фенотипу. Однак перенесення цих попередніх результатів в клініку ще не дав обнадійливих результатів. У фазах I і II клінічних випробувань на хворих НМРЛ з мутацією гена р53 введення в пухлину ретровирусного вектора з диким типом р53 не дало ефекту. Є підстави вважати, що успішна корекція гена р53 в поєднанні з хіміотерапією, наприклад цисплатином, можрт зменшити пухлинну експресію в клітинах цієї лінії.
Переривання експресії мутаітмого онкогена антисмислового олигонуклеотидами
Протоонкогени - гени, що активуються в процесі канцерогенезу. Генним продуктом буває білок (наприклад, фактор росту або фактор транскрипції), що грає істотну роль в регуляції клітинної проліферації. Для порушення нормальної регуляції поділу клітин протоонкогенах досить мутації (спадкової або придбаної) лише однієї його копії. Антисмислового олігонуклеотиди ДНК являють собою короткі синтетичні нуклеотидні послідовності, комплементарні специфічним послідовностей ДНК або РНК, які конструюються на окремих онкогенах. Мета застосування антисмислових олігону-клеотідов - придушення транскрипції в мРНК або трансляції з мРНК білка. Це обмежує експресію гена і тим самим утворення генного продукту.
Так, bcl-2 являє собою онкоген, який грає роль в розвитку раку простати, резистентного до гормональної терапії. Експресія гена bcl-2 сприяє професії пухлини. Гіперекспресія bcl-2 викликає резистентність клітини до апоптозу. Цей ген є мішенню антисмислової молекули G3139. Препарат облімерсен (генасенс), створений на основі цього олигонуклеотида, в даний час проходить клінічні випробування на хворих з далеко зайшли раком простати. Іншим прикладом антисмислового олигонуклеотида, що проходить клінічні випробування, служить ISIS 3521 (аффінітак), його мета - нерецепторная Тирозинкіназа. щільність якої збільшується при ряді солідних пухлин, включаючи НМРЛ.
Генна активація пролекарства
Основний недолік сучасних хіміопрепаратів - відсутність вибірковості дії. Підвищити вибірковість можна за допомогою методу перенесення генів. Таргетування включає наступні етапи.
- Ген, що кодує фермент, який активує ліки, впроваджують в пухлинні клітини.
- Після цього регулярно вводять пролекарство.
- Активує фермент перетворює пролекарство в токсичний метаболіт
- Пухлинна клітина гине в результаті наступних змін: локальне утворення цитотоксического метаболіти; так званий ефект «свідка», при якому нетрансгенная клітина, перебуваючи в змішаній популяції клітин, гине в присутності даного пролекарства внаслідок дифузії останнього, активного транспорту і включення місцевого імунної відповіді; це може забезпечити ефективність методу навіть за відсутності високоефективного переносу гена.
Мета методу перенесення генів - знищити якомога більше пухлинних клітин, звівши до мінімуму системні токсичні ефекти.
Метод відомий під різними назвами:
- терапія генної активацією пролекарства (GPAT - genetic pro-drug activation therapy);
- генна регуляція ферментної системи пролекарства (GDEPT - gene-directed enzyme pro-drug system);
- терапія, заснована на регуляції ферментів пролекарства за допомогою вірусних векторів (VDEPT- virus-directed enzyme pro-drug therapy), перенесення генів здійснюється за допомогою вірусних векторів;
- Суицидная генотерапія.
Основні недоліки методу генної активації проліків такі:
- недостатньо ефективне перенесення генів в пухлинні клітини, пов'язаний з недосконалістю наявних векторів;
- необхідність в безпосередній внутрішньопухлинно ін'єкції генів, при якій ефект не носить поширений характер, а обмежується лише самою пухлиною.
В даний час дослідження, покликані відповісти на питання, чи може енна активація пролекарства бути переведена з області теорії в практичну площину, поки не завершені. Одним із прототипів ферментної системи пролекарства, яка активується геном, служить нітроредуктаз бактерій. Вона перетворює пролекарство СВ1954 (його можна вводити внутрішньовенно або внутрішньочеревно, не побоюючись ускладнень) в високотоксична алкилирующее речовина нітробензамідін. Ген нітроредуктази можна було б ввести в пухлину шляхом безпосередньої ін'єкції. Подальше системне призначення пролекарства СВ1954 призвело б до відрази його в цитотоксический нітробензамідін лише в тому випадку, якщо ген вбудувався в клітинний геном. Терапевтична ефективність цього методу поки не доведена, але дослідження у хворих на рак печінки в даний час тривають.
генна иммуномодуляция
неспецифічна імунотерапія
Мета неспецифічної імунотерапії - підвищити імунну відповідь взагалі, а не викликати імунну реакцію проти будь-якого конкретного антигену. Хворого імунізують речовинами, що викликають імунну реакцію, здатну зупинити або сповільнити ріст пухлини. Раніше були проведені дослідження з БЦЖ і цитокінами, зокрема ІФН альфа та ІЛ-2.
специфічна імунотерапія
Розробляють численні методи індукції імунної відповіді на специфічні пухлинні антигени.
Антигени-мішені повинні мати наступні властивості:
- експресуватися тільки в пухлинних клітинах і лише в дуже невеликій кількості в інших тканинах;
- експресуватися як клітинами первинної пухлини, так і клітинами її метастазів;
- розпізнаватися імунною системою або на клітинної поверхні, або у вигляді фрагментів, пов'язаних з білками головного комплексу гістосумісності (МНС).
У наступних розділах висвітлені розробляються в даний час методи індукції специфічних протипухлинних імунних реакцій.
Препарати з цілісних пухлинних клітин
Індивідуальні вакцини для кожного хворого, створювані на основі матеріалу, отриманого з власної пухлини, і зазвичай вводяться з ад'ювантним препаратом, наприклад БЦЖ.
Відпадає необхідність в ідентифікації специфічних пухлинних антигенів.
Можливості отримання високоімуногенний вакцин для клінічного застосування обмежені.
Отримано обнадійливі результати застосування протипухлинної вакцини на невеликій групі хворих, прооперованих з приводу раку товстої кишки. Вакцина кілька збільшувала тривалість безрецидивного періоду.
Якщо виділити та ідентифікувати пухлинний антиген, то пептиди, отримані з цього антигену, можна використовувати в якості елітопов для імунотерапії. Для стимуляції імунітету можна використовувати також синтетичні епітопи. До теперішнього часу в клініці випробовували внутрикожное або підшкірне введення, зазвичай у поєднанні з імунологічним ад'ювантом БЦЖ. Подальше введення антигену підвищує можливість розпізнавання пухлини завдяки імунологічному нагляду і, отже, її відторгнення. Прикладом специфічного пухлинного пептидного антигену, в даний час вивчається, служить Муцин. Він являє собою високомолекулярний гликопротеид, експрессіруемий на клітинах слизової оболонки шлунково-кишкового тракту. При ряді злоякісних пухлин, у тому числі раку підшлункової залози і товстої кишки, відзначають його гіперекспрессію. Поки що недостатньо даних, що підтверджують кореляцію між імунною відповіддю і клінічним ефектом.
Замість використання в якості антигену опухолеспеціфіческіх білка можна вибрати в якості мішені ген, зазнає гіперекспрессію у хворих з пухлиною. Для цього потрібно створити рекомбинантную ДНК-вакцину, в якій використовується вектор для перенесення ДНК, що кодує опухолеспеціфіческіх білок. Подання антигенного білка індукує гуморальний і клітинний імунітет. В якості мішеней для ДНК-вакцин вибирають такі субстрати.
- Мутантний ген-супресор пухлинного росту 053. присутній більш ніж у 50% хворих на рак.
- Раково-ембріональний антиген - глікопротеїн клітинної мембрани, його гіперекспрессію відзначають у більшості хворих на рак товстої кишки. У нормі низький рівень експресії цього антигену відзначають в клітинах слизової оболонки товстої кишки і жовчних шляхів. Ген. кодує раково-ембріональний антиген, вбудовують в різні вектори для застосування в якості вакцини. Хоча численні клінічні випробування в фазах I і II підтвердили хорошу переносимість ДНК-вакцин проти раково-ембріонального антигену, доказів його клінічної ефективності поки немає
- MAGE-1 - ембріональний генний продукт, асоційований з раком молочної залози і меланому.
- Білок Her-2 / neu - рецептор ЕФР, внутрішньоклітинний домен якого володіє тірозінкіназной активністю.
Недолік методу ДНК-вакцин - обмежена кількість опухолеспеціфіческіх антигенів. Більшість антигенів-мішеней не бувають строго специфічними для пухлини і експресуються, хоча і в меншій кількості, нормальними клітинами. Протипухлинні вакцини ще повинні пройти клінічні випробування.
Вакцинація дендритними клітинами
Вплив на імунну систему, щоб вибірково націлити її проти пухлинної тканини, пов'язане з численними труднощами. Вкрай важливим є вибір відповідного антигену. Однак успіх залежить також від оптимального подання цих антигенів імунній системі. Необхідність забезпечити ефективне представлення привела до введення антигенів з дендритними клітинами. Дендритні клітини мають виражену здатність процесингу та подання антигену, необхідної для розвитку первинного обмеженого по HLA Т-клітинного імунітету, такого важливого при інфекціях, аутоімунних захворюваннях і злоякісних пухлинах. Ці клітини експресують значна кількість молекул HLA та інших мембранних молекул. Досягнення останніх років в технології досліджень дозволили культивувати дендритні клітини in vitro з попередників, одержуваних з крові і кісткового мозку з використанням дітокінов. У культивовані дентрітние клітини можна ввести екзогенний антиген наприклад, пухлинний білок, пептид або РНК) або ген, що кодує пухлинний антиген (за допомогою перенесення фізичними методами або вірусними векторами). Можна сподіватися, що одночасне введення з дендритними клітинами антигену максимально посилить наступний Т-клітинну відповідь і, отже, поліпшить упізнання пухлинного пептиду. Однак дендритні клітини важко культивувати, а клінічних випробувань, проведених до теперішнього часу, трохи, і асі вони знаходяться лише на ранній стадії.
доставка генів
Для успіху генної терапії необхідні системи доставки, за допомогою яких помилково ефективно перенести ген без шкоди для клітини. Методів доставки генів кілька.
- ін'єкція ДНК в кісткову м'яз за допомогою звичайного шприца і голки;
- перенос ДНК за допомогою ліпосом;
- балістична трансфекція за допомогою мікрочастинок золота, покритих плазмидой ДНК ( «генна гармата»).
Переваги фізичного методу - зручність і безпеку. До недоліків відносять низьку ефективність переносу гена і тимчасовий характер його експресії.
Біологічні методи, наприклад перенесення за допомогою:
- бактеріальних векторів;
- вірусних векторів.
Перевага використання біологічних векторів в тому, що це найбільш ефективний і стабільний метод, що забезпечує вбудовування ДНК в значну кількість кпеток-мішеней. До недоліків цього методу відносять складність методики і можливість утворення в організмі господаря нейтралізують антитіл.
Системного введення генів перешкоджають наступні фактори:
- висока частота перехресної імунної реакції з антитілами;
- висока імуногенність векторів.
Тому перенесення генів біологічним методом здійснюють шляхом місцевої ін'єкції.
Вибір вектора для перенесення ДНК залежить від мети лікування:
- для заміни гена бажано використовувати високоефективні вірусні вектори;
- для нетривалого ефекту, необхідного для індукування імунної відповіді або сенсибілізації клітин до променевої терапії, можна використовувати ліпосоми.
Доставка може бути наступних видів:
- ex vivo - перенесення лікувального гена в ізольовану пухлина або ракові клітини, які потім реімплантіруют в організм господаря;
- in vivo - доставка генів до клітин-мішеней, заснована на відмінностях в транскрипції специфічних генів між пухлинними і нормальними клітинами; цей метод для перенесення генів менш ефективний.