Щоб зміцнити становище новостворюваної обителі, А. І. Ходкевич і єпископ Смоленський Іосиф Солтан записали в її користь земельні угіддя в різних місцях Гродненської губернії, які давали монастирю щорічно 30 000 рублів доходу. За статутом, даним Супрасльського монастирю його засновниками, обитель ця знаходилася в залежності від Київських митрополитів, які, втім, без зносини з ктиторами Ходкевича не могли втручатися в її внутрішні справи. Архімандрит обирався з числа братії і присвячувався в сан митрополитом з відома і згоди Ходкевичей.
Протягом XVI ст. число братії в монастирі коливалося від 70 до 100 чоловік. Багато з них прославилися високими чернечими подвигами; було серед них і кілька пустельників, які жили в особливому скиту. Воювала в обителі і вчені ченці, які збирали книжкові рідкості, в результаті чого в монастирі склалася велика бібліотека - головним чином, з святоотецьких писань на різних мовах (слов'янською, грецькою, латинською та польською). Деякі з учених ченців залишили і власні твори, написані в XVI-XVII ст. і спрямовані на викриття помилок латинян та іудеїв.
Значення Супрасльського монастиря було дуже велике, і його стіни бачили не тільки простих прочан, а й багатьох бояр, князів і навіть деяких коронованих осіб. Так, 1543 р обитель відвідав король Польський і великий князь Литовський Сигізмунд Казимирович, який приїжджав (як сказано в монастирському літописі), «щоб бачити церква і місцевість і чути молебний спів. Він був на богослужінні, яке вислухав від початку до кінця, входив до вівтаря, оглядав хрести і євангелія. За огляді церкви ходив по монастирю, був в трапезі; потім, по роздачі милостині убогим, відбув з монастиря в розчулення ».
При введенні в Західній російської церкви унії настоятель Супрасльського монастиря архімандрит Іларіон, який був присутній в числі інших православних владик на Брестському соборі 1596 р написав засудження на прийняли унію. А в 1601 році разом з братією він проголосив у церкві анафему на Київського митрополита Іпатія Потіючи, який прийняв унію, за що був засуджений королівським указом на вигнання. Через 2 роки ієромонах Герасим Веліконтій, обраний в настоятелі Супрасльського монастиря, дав зобов'язання бути в єдності з римською церквою. Але моральні сили обителі були такі великі, а дух православного чернецтва настільки живучий, що, зовні перебуваючи в унії, монастир ще майже ціле століття зберігав всі ознаки віри істинної і славної. Уніатський митрополит Кипріян Жоховський в кінці XVII ст. наказав було своєму наміснику стригти братії волосся і голити бороди, але ченці повстали проти цього і поскаржилися римському папі за примус «здійснювати обряди по двох віросповідань».
Після введення унії і спокушання ктиторов Ходкевичей в католицтво монастир (на той час вже мав статус лаври), незважаючи на свої великі кошти, став швидко занепадати. Благочестя серед ченців зменшувалося, число братії зменшувалася, і Київський митрополит Петро Могила в листі до ректора Київської духовної академії Кассианом Сасовічу (відступника від віри православної) писав про монастир:
«А нині до чого він доведений? Де колись, під керуванням православних, було до ста або, по крайней мере, до сімдесяти чоловік братії, там нині живе ледь кілька ченців. І що ще гірше - мирської пан володіє церковним багатством і селами і через своїх рабів виділяє ченцям платню, як захоче. Запитай тільки в тому монастирі кого-небудь, де ті давні ікони, які прикрашені були срібними і позолоченими ризами? І дізнаєшся, що вони звернені уніатами на свої потреби; замість ж срібних ікон поставлені до церкви полотняні італійські. Добре змінюються з Богом: Йому - полотно писаний, а собі - срібло Визолочена! ».
Коли архімандритом Супрасльського монастиря став Полоцький архієпископ Гавриїл Коленда, той обрав монастир своєю резиденцією і часто влаштовував в ньому бенкети для гостей. І обитель прийшла в таку бідність, що часто не вистачало вина для богослужінь, а ченці не мали навіть ряс і ходили в одних плащах, виконавши в них дірки для рук. Коли ж братія змушена була доповісти про все архімандриту, той прийшов в такий гнів, що, їдучи в Полоцьк, так «благословив» обитель: «Чекайте, дочекаюся я того, що на цьому місці будуть жити і співати тільки горобці».
Довго ще тривали лиха монастиря, але були у нього і щасливі часи. Так, в кінці XVII ст. в обителі відкрили друкарню, в якій друкувалися богослужбові книги слов'янською мовою. При друкарні була і своя паперова фабрика.
Супрасльские ченці навіть в уніатський період залишили по собі добру пам'ять, що переходила з століття в століття. Багато при вступі в монастир вносили значні пожертви: так, вівтар соборного храму був розписаний і прикрашений ліпниною на вклад одного ченця. А розписував його ієромонах Антонін Грушецький - колишній живописцем при королівському дворі.
У 1807 р Білостоцький край був приєднаний до Російської імперії, але уряд Пруссії, під владою якої він перебував довгий час, встигла відібрати у монастиря все його маєтку. У обителі залишалося тільки те, що знаходилося в її огорожі. Натомість маєтків монастиря було призначено допомогу в розмірі 2220 талерів на рік і 75 сажнів дров. Монастир намагався повернути собі хоча б частину відібраних маєтків, але безуспішно. Через кілька десятиліть з державної скарбниці монастиря виділили 92 десятини землі і 23 десятини сіножатей по річці Супрасль. Через 20 років було відведено ще 150 десятин лісі замість дров, до того відпускати натурою.
У 1839 р Супрасльский монастир возз'єднався з Православною церквою, в 1865 р в його стінах розташувалося духовне училище, яке знаходилося на утриманні монастиря (крім платні вчителю). Зі скороченням монастирських засобів скоротився і склад братії, тому більша частина монастирських будівель була зайнята під госпіталь. Військове відомство будинків не ремонтувало, і вони поступово приходили майже в повну непридатність. Через це монастир змушений був віддати багато своїх будинків в оренду під суконну фабрику німцеві Захерту. Одночасно той взяв в оренду і монастирський фільварок з умовою володіння на весь час, поки буде платити за оренду 450 рублів на рік. А в відданих будівлях розташовувалися монастирська бібліотека, трапеза, кухня з коморами, приміщення колишньої друкарні, палітурна майстерня! Але так як умови контракту були невигідними, в 1883 р усі віддані в оренду будівлі були продані за більш високу ціну - того ж Захерту ...
Всі кам'яні будівлі монастиря побудовані в XVIII в. але пожежа 1895 р знищив дахи на братських корпусах. Після цієї катастрофи над середнім одноповерховим корпусом був надбудований другий поверх, потім побудували нову трапезу з кухнею, баню, пральню і кам'яну огорожу.
До кінця XIX в. в монастирі існувала кам'яна однопрестольний церква в ім'я Благовіщення Пресвятої Богородиці. Спочатку в ній були влаштовані два бокового вівтаря: один - на честь святих мучеників Бориса і Гліба, інший - на честь преподобних отців Печерських Антонія і Феодосія. З введенням унії прибудови ці були знищені; замість них влаштували за зразком римських вівтарі, поставлені при двох колонах, що підтримують середній купол храму. Вівтарний живопис ще в кінці XVIII ст. була змінена в італійському стилі, а нижня частина стін всередині церкви по вікна була закладена дошками. Верхню частину і все інше простір через застарілої живопису забілили вапном. Коли в 1887 р вапно зняли і зображення промили водою, церковний живопис частково повернула собі первісний вигляд.