Кріозбереження - заморожування при наднизьких температурах. Зазвичай його проводять в рідкому азоті при температурі -196 o C.
Успіх низькотемпературної консервації залежить від ряду факторів:
- вид і тип клітин,
- їх концентрація в суспензії,
- склад середовища для консервування,
- вид і концентрація кріопротектора,
- режим охолодження і відігрівання,
- спосіб реабілітації клітин після відігрівання.
Істотну роль в успішному заморожуванні клітин відіграє їх морфофизиологическое стан: клітини, що знаходяться в стаціонарній фазі росту, менш стійкі до шкідлива дія низькотемпературної консервації, ніж клітини, які знаходяться в експоненційної фазі росту. Клітини для заморожування відбирають в середині експоненційної фази ростовой кривої.
Важливе значення має і щільність замораживаемой суспензії. Оптимальні результати по відновленню клітин були отримані при заморожуванні клітинної суспензії щільністю 1 * 10 5 - 5 * 10 6 клітин в 1 мл.
Для рослинних клітин часто потрібна попередня культивування в особливих умовах. У середу додають різні речовини, наприклад:
- 2-6% маннит або сорбіт для зменшення розміру вакуолей;
- амінокислоти, в першу чергу пролин, який служить для зв'язування води в клітці (концентрація до 1 благаючи або 11,5%), аспарагін, # 947; -аміномасляную кислоту;
- диметилсульфоксид (ДМСО), який додають до середовища для предкультівірованія в концентрації від 2,5 до 10% на 48 годин для збільшення проникності цитоплазматичної мембрани;
- крім того, застосовують штучне загартовування до холоду, коли знижують температуру культивування, імітуючи природний осінній процес підготовки до періоду зимового спокою (застосовується лише для рослин помірного клімату). Клітинні культури витримують кілька діб при температурі +8 - +10 o C, а потім при +2 - +5 o C протягом 1 - 6 тижнів.
Процес заморожування рослинних клітин від тварин відрізняє, в основному, наявність етапу попереднього культивування.
Кріопротектори - речовини, що дозволяють знизити шкідливу дію фізико-хімічних факторів при кріоконсервуванні. До них відносяться сахароза, декстран, етиленгліколь, полівінілпіролідон, диметилсульфоксид (ДМСО), гліцерин. Для визначення токсичності кріопротектори клітини витримують при кімнатній температурі в різних його концентраціях протягом 30 - 50 хвилин, після чого визначають їх життєздатність. Додатково оцінюють його протективного властивості шляхом пробного заморожування і відтавання культур. Найбільш часто в якості кріопротекторів використовують гліцерин і ДМСО. Перед додаванням кріопротектори суспензію клітин концентрують шляхом центрифугування, надосадову рідину зливають. Кріопротектори вносять в культуру за годину до заморожування, що призводить до зміни проникності мембрани, зміни точки замерзання і відтавання.
Програми охолодження можуть бути різними, але для всіх них характерна повільна швидкість охолодження. При заморожуванні відбувається утворення льоду всередині і зовні клітин. Характер цих змін залежить від досліджуваного зразка і обробки кріопротекторами, але головним чином, від швидкості охолодження. При повільному охолодженні відбувається утворення позаклітинного льоду, що приводить до зневоднення клітини до того, як буде досягнута точка замерзання цитоплазми. При швидкому охолодженні клітини швидше заморожуються зсередини, повільніше обезвоживаются, що призводить до утворення кристалів льоду всередині клітини. В цьому випадку клітини пошкоджуються. Зазвичай охолодження проводять в два етапи (рис. 26):
Мал. 26. Заморожування клітин: а) швидке, б) повільне, поетапне
1-й етап: від +20 до -28 o C зі швидкістю 1 градус в хвилину (для рослинних клітин швидкість заморожування 0,5 градуса в хвилину до -35 ° С), витримують при цій температурі 15 хвилин.
2-ий етап: занурення в рідкий азот (миттєве охолодження до - 196 o C).
Заморожування виробляють в спеціальних апаратах. При їх відсутності - на спиртовій лазні (0,5 - 1 літр спирту наливають в термос з металевою колбою, занурюють в нього ампули на 15 хвилин і додають при помішуванні рідкий азот або сухий лід; доводять температуру до -32 o C (температура повинна бути не вище -28 і не нижче -32 ° С). Далі переносять ампули в рідкий азот.
При розморожуванні ампули пінцетом переносять у водяну баню з температурою +37 - +40 о С, ампула об'ємом в 1 мл розморожується протягом 0,5 - 1 хвилини.
Після розморожування клітини відмивають або в ростовий середовищі (тварини), або в підтримуючої середовищі. Рослинні клітини також можна відмивати 3 - 10% розчином сахарози.
Далі клітини перевіряють на життєздатність за допомогою вітальних барвників, фарбувальних мертві клітини. Остаточним критерієм служить чітке відновлення зростання на стандартних поживних середовищах, що використовуються для вирощування цієї культури.
Перещеплюваних клітин тварин після розморожування мають підвищену чутливість до вірусів, яка проявляється протягом перших двох пасажів. Далі чутливість повертається до вихідної.