Мікоплазми - прокаріоти, що не мають клітинної стінки і обмежений-ні лише тришарової мембраною. Мають поліморфізмом (коки, нитки, гіллясті структури), ростуть на безклітинних поживних середовищах. У свя-зи з відсутністю клітинної стінки чутливі до осмотичного шоку. Для запобігання осмотичного лізису до складу поживних середовищ вклю-чають стабілізуючі солі та інші речовини. Патогенні мікоплазми для зростання на штучних поживних середовищах вимагають додавання мно-гих компонентів, які вони не здатні синтезувати самі. До складу середовищ обов'язково включають сироватку крові як джерело ліпопротеїну. Поряд зі стеринами, фосфоліпідами, ліпідами патогенним мікоплаз-мам необхідний низькомолекулярний білок. У зв'язку з вищевикладеним ми-коплазми вирощують на середовищах з сироваткою крові, екстрактами дрож-лень, серцевого м'яза, додаванням мембранних ліпідів або їх предше-ственник.
Температурний оптимум для мікоплазм, уреаплазм і ахолеплазм со-ставлять 37-38 ° С, рН 7,8-8,0, крім уреаплазм (оптимум рН 6,0).
Все мікоплазми виділені в самостійний клас Mollicules з одним загоном - Mycoplasmatales. який поділяється на три сімейства: Mycoplasmataceae, Acholeplasmataceae, Spiroplasmataceae. Сімейство Mycoplasmataceae включає два роди: Mycoplasma і Ureaplasma. Сімей-ство Acholeoplasmataceae має один рід - Acholeoplasma. Сімейство Spiroplasmataceae представлено одним родом - Spiroplasma.
Схема бактеріологічного дослідження при діагностиці
мікоплазмозів
Матеріал беруть на ранніх стадіях клінічного прояву хвороби, від трупів тварин не пізніше 2-3 год після загибелі, з максимальним соблю-ням стерильності і транспортують в термосі з льодом. Ізоляція мі-коплазм найбільш імовірна, якщо посів на поживні середовища проведений в перші п'ять годин після взяття матеріалу. Для зберігання протягом 2-3 діб матеріал заморожують при -20 ° С, для більш тривалого - при -70 ° С або поміщають в рідкий азот. Матеріал, взятий тампонами, доцільність-різному поміщати в транспортну середу для мікоплазм. При транспортуванні зразків маститного молока рекомендується в нього додавати 5 мкг / мл ампі-циллином.
Пряме мікроскопічне виявлення мікоплазм в забарвлених пре-Параті з досліджуваного матеріалу через поліморфізму, слабкого Сприйми-ку барвників і крихкості клітин має невелику діагностичну цінність. Більш ефективно виявлення та ідентифікація мікоплазм при по-мощі методу флуоресціюючих антитіл, ІФА, ПЛР.
З метою виділення культури мікоплазм зазвичай матеріал висівають в дві пробірки з рідким живильним середовищем і в дві чашки Петрі з агарної середовищем. Ексудат і фетальний рідина висівають на середовища без попе-редньо обробки. Тканинний матеріал і внутрішньосуглобова рідина можуть містити інгібітори, тому їх розводять в рідкому поживному середовищі до 10 "6 і кожне розведення инкубируют. Тканини попередньо го-могенізіруют. Гомогенізацію проводять в фосфатному буферному розчині або рідкому поживному середовищі. Надмірно подрібнювати тканини не рекоменду-ється з -за виділення інгібіторів, приготування розведень гомогената переслідує цю ж мету.
Щільні живильні середовища краще розливати в скляні чашки Петрі, тому що неко-торие види пластмас інгібують зростання мікоплазм.
Посіви на щільних середовищах інкубують протягом 5-14 діб в аероб-них і анаеробних умовах при 37-38 ° С, а оскільки культивування досить тривалий, щоб уникнути підсихання середовищ його проводять при відносній вологості близько 75-80%. Найкращі результати вдається отримати при використанні культуральних судин з 5-10% СО2. Пробірки з посівами в рідкі поживні середовища інкубують в аеробних умовах і щодня контролюють на на-відмінність зростання.
Для підтвердження зростання мікоплазм на рідких поживних середовищах виробляють висіву на щільне ПС. Результат посіву на щільні середовища визнають негативним при відсутності росту протягом 14 діб. На щільних середовищах наявність колоній виявляють під малим збіль личением мікроскопа (х25 х50). При відсутності росту проводять до
8 пас-сажею на рідкому середовищі з п'ятиденним інтервалом, перш ніж дають отри-цательного висновок. З метою виділення уреаплазм пасажі проводять на спеціальних середовищах щодня.
Мікоплазми утворюють досить характерні колонії на щільних пі-тательних середовищах. Центр колонії темний, периферія прозора. Рельєф: центр піднятий ( «пуговчатий»), периферична частина колонії пло-кая (форма «яєчні»). Центральна частина колонії вростає в товщу живильного середовища, що виявляють шляхом зняття бактеріальної маси фламбіровать скальпелем або бактеріологічною петлею з пос-ледующім вивченням ділянки середовища під колонією за допомогою микроско-па.
При виявленні колоній, схожих з колоніями мікоплазм, проводять клонування на середовищах без інгібіторів з метою отримання чистої куль-тури. З бульонной культури готують розведення 10 -1 -1 - 10. кожне з ко-торих (0,2-0,3 мл) висівають на дві чашки Петрі з агарної середовищем. Для виділення чистої культури використовують два основних методичних при-ема. У першому випадку вирізують блок агарового середовища, що містить одну колонію, перевертають і засівають на поверхню щільного живильник-ної середовища. Посіви інкубують 48-72 години. Процедуру повторюють вже з трьома ізольованими колоніями. У другому випадку агаровий блок примі-ють в пробірку з 2-3 мл рідкого живильного середовища, інкубують
48 ча-сов при 37 ° С, культуру пропускають через мембранні фільтри (діаметр пор 0,45 мкм). Фільтрат розводять свіжим середовищем 1:10 і 1: 100 і по бактерії-логічної петлі кожного розведення висівають на агарове середовище. Про-цедуру повторюють тричі з декількома колоніями, тому що не всі коло-ванні дають хороший зростання.
Під впливом інгібіторів, що входять до складу поживних середовищ для первинного культивування мікоплазм, можлива L-трансформація бактеріальних контамінантів, що вимагає диференціації колоній
L-форм бактерій і мікоплазм.
Колонії L-форм бактерій мають подібну морфологію, але менш про-прозорі і мають виражену зернисту структуру.
Для більш точної диференціації мікоплазм від L-форм бактерій про-переводять висів колоній на поживну агарове або рідку середу без пеніциліну і ацетату талію. Посіви інкубірют протягом п'яти днів, періодично переглядаючи на наявність колоній на агарі і типових бак-матеріальних клітин в рідкому середовищі. Їх присутність свідчить про ре-версії L-форм в початковий стан.
Крім того, колонії мікоплазм і L-форм бактерій диференціюють при фарбуванні за методом Дінес. Для цього вирізають агаровий блок з досліджуваної колонією, наносять кілька крапель барвника Дінес (метиленовий блакитний - 2,4 г, мальтоза - 10 г, АЗУР II - 1,25 г, натрію хлорид - 0,25 г, дистильована вода - 100 мл) на кілька хвилин, промивають блок водою і досліджують. Спочатку все колонії забарвлюються в синій колір, але через п'ятнадцять хвилин колонії бактерій, в отли-чие від мікоплазм, знебарвлюються за рахунок редукції метиленового синього. Також враховують, що колонії звичайних бактерій при фарбуванні можуть сми-тися, а микоплазм немає.
Для визначення морфологічних ітинкторіальних властивостей клітин мікоплазм готують на стеклах відбитки колоній, бульонную культуру цін-тріфугіруют при 10-15 тис.g, осад одноразово відмивають дистилюється-ванною водою і готують мазки. Препарати фіксують метанолом, ацето-ном і забарвлюють по Граму і фарбою Романовського-Гімза (1:10) 3-4 години. За Грамом мікоплазми фарбуються негативно, барвником Ро-мановскіх-Гімза мікоплазми та ахолеплазми - в світло-фіолетовий, уреаплазми - у червоно-фіолетовий колір.
Культури мікоплазм в процесі роботи підтримують шляхом пересіву на рідких поживних середовищах з інтервалом 2-3 тижні і зберігають при 4-5 ° С. Агарові культури зберігають у замороженому стані у вигляді ага- рових блоків при-30 -------- ------------- 40 ° С.
Родову ідентифікацію виділених чистих культур мікоплазм (пологи Mycoplasma, Ureaplsma, Acholeplasma) здійснюють по чувствітельнос-ти до дигітоніну і уреазний активності з урахуванням діаметра мікроколоній за схемою, представленої нижче.
Видову ідентифікацію мікоплазм здійснюють шляхом подальшого вивчення додаткових характеристик, ферментативної активності. На різних етапах бактеріологічного дослідження застосовують серол-ня методи ідентифікації мікоплазм. При діагностиці деяких мікоплазмозів практикується проведення біологічної проби і серол-гическая діагностика.
Основні методи досліджень, які використовуються при ідентифікації ми-коплазм, викладені нижче.