Мікроскопія в темному полі зору. Бактериоскопия в темному полі зору-основний метод дослідження шкірних вогнищ, таких як шанкр первинного сифілісу або кондилома вторинного сифілісу. При мікроскопії в темному полі матеріалу сухих макулопапулезной вогнищ вторинного сифілісу виявити збудник вдається далеко не завжди, тому краще піддавати дослідженню аспірат з лімфатичного вузла. Поверхня підлягає дослідженню виразкового вогнища очищають ватно-марлевим тампоном, потім обережно масажують стерильним марлевим тампоном, так щоб не викликати кровотечі. Потім вогнище ураження злегка здавлюють, щоб викликати виділення серозного транссудату, краплю якого поміщають на предметне скло. При необхідності транссудат змішують з рівним об'ємом ізотонічного розчину (без додавання бактериостатических засобів), покривають покривним склом і негайно досліджують у темному полі зору або під фазово-контрастним мікроскопом на наявність збудника. Дослідження має проводити досвідчений працівник. Одноразовий негативний результат не виключає наявності сифілісу, так як для виявлення трепонем в 1 мл транссудату повинне бути присутнім принаймні 10 4 мікробних тіл, а негативний результат може бути зумовлений попереднім місцевим застосуванням антисептиків або очищенням вогнища, виробленим обстежуваним хворим. У зв'язку з цим необхідно уникати очищення осередку ураження або місцевого застосування медикаментів, а дослідження в темному полі зору слід повторювати протягом трьох послідовних днів, перш ніж вважати результати його від'ємний.
Пряма імунофлюоресценція. У більшості випадків захворювання на сифіліс діагностується в прийомних приватних лікарів, але тим чи іншим причинам не застосовують дослідження в темному нулі зору, і це викликало необхідність в розробці альтернативних методів ідентифікації трепонем в ексудаті.
Застосовуваний в центральних лабораторіях тест прямої імунофлюоресценції антитіл (DFA-TR) заснований на використанні кон'югованих з флюоресцеином поліклональних антитіл для виявлення Т. pallidum в фіксованих мазках, приготовлених з магеріала, отриманого з підозрілих на сифіліс вогнищ. Наявність антитіл, що перехресно реагують з санрофітірующімн непатогенними спірохетами і фарбувальних їх, обумовлює ретельну абсорбцію антисироватки з використанням істинного збудника з метою отримання специфічного реагенту.
Розроблено вдосконалена техніка реакції прямої імунофлюоресценції, при якій використовуються моноклональні антитіла, специфічні тільки по відношенню до патогенних спірохет. У клінічних випробуваннях цієї методики було показано, що вона також чутлива і специфічна, як і дослідження в темному полі.
Виявлення Т. ра llidum в тканинах. При наявності клінічних або гістологічних ознак, що дозволяють запідозрити діагноз сифілісу, для його підтвердження часто виникає необхідність виявити Т. pallidum в тканинах. Хоча мікроорганізм порівняно легко може виявлятися методом сріблення, результати слід оцінювати з обережністю, так. до ак часто виявляються артефакти. Більш вірогідним вважається виявлення трепонем в тканинах за допомогою моноклональних або поліклональних антитіл до бліда трепонема.
Серологічна діагностика сифілісу. Різноманіття серологічних реакцій для діагностики сифілісу призводить до непотрібних ускладнень. Сифілітична інфекція викликає утворення двох типів антитіл, неспецифічних реагінових антитіл і специфічних антітрепонемних антитіл, які визначаються за допомогою тестів, спрямованих відповідно на виявлення нетренонемних н трепонемним компонентів (табл. 122-1). Як ті, так і інші тести використовуються у осіб з будь-якою інфекцією, викликаної трепонемами, будь то фрамбезия, пінта або ендемічний сифіліс.
Нетрепонемні антитіла, які утворюються при сифілісі, містять IgG- і IgM-імуноглобуліни, спрямовані проти ліпоїдного антигену, що утворюється при взаємодії Т. pallidum з тканинами макроорганізму, і, ймовірно, проти ліпоїдного антигену самої Т. pallidum. Термін реагіни невдалий, тому що не мають до нього відношення антитіла IgE, які беруть участь в деяких алергічних феномени, також відомі як реагіни.
Найбільш широко вживаними лабораторними тестами для виявлення нетрепонемних, або реагінових, антитіл є прискорений тест виявлення реагинов в плазмі (RPR), який може бути автоматизований (ART), і VDRL-тест на склі (названий так але назвою лабораторії Venereal Disease Research Laboratory, яка запропонувала його н розробила спеціальний антиген-прим. пере ст.). Іншими менш поширеними тестами для виявлення нетрепонемних антитіл є тест визначення непідігрітої сироваткових реагинов (USR) і ті ст скр інінга реагинов (RST). У цих тестах антитіла виявляються на підставі мікроскопічної (VDRL, USR) або макроскопічної (RPR, RST) флоккуляции суспензії антигену (див. Табл. 122-1)
Тест RPR більш дорогий, ніж тест VDRL, але простіше у виконанні і не вимагає підігріву сироватки. Він є методом вибору при необхідності термінової постановки діагнозу в клінічних або амбулаторних умовах. Реагенти для тесту VDRL значно дешевше, але їх необхідно готувати щодня. Хоча для заміни VDRL-тесту розроблені більш прості макроскопічні методи, зокрема RPR-дослідження сироватки, що використовується в багатьох лабораторіях, VDRL-тест залишається стандартним для дослідження спинномозкової рідини.
RPR- і VDRL-тести однаково чутливі і можуть використовуватися для початкового скрінннга або кількісного визначення титру сироваткових реагінових антитіл. Титр реагінових антитіл відображає активність процесу: при нрогрессірованіі первинного сифілісу може спостерігатися чотириразове або більше збільшення титру реагінових антитіл; титри, які визначаються за допомогою VDRL, як правило, становлять 1:32 і вище при вторинному сифілісі; перси ггірующее зниження титру після лікування раннього сифілісу є важливим доказом ефективності терапії. Титри, встановлені за допомогою RPR, не корелюють повністю з титрами VDRL, і при подальшому кількісному визначенні титрів (для оцінки ефективності проведеного лікування) слід користуватися будь-яким одним тестом.
Для виявлення специфічних антитіл проти трепонем існують три стандартних методу: реакція абсорбції флуоресцентних антитіл до трепонема (FTA-ABS), реакція мікрогемагглютінаціі для виявлення антитіл до Т. pallidum (МНА-ТР) н реакція гемагглютннаціі трепонем на сифіліс (HATTS). Останній гемагглютінаціонний тест широко використовується в Канаді і в Європі, але не набув поширення в Сполучених Штатах Америки.
Для постановки реакції FTA-ABS сироватка хворого попередньо розлучається з субстанцією, що містить антигени непатогенних спирохет (сорбент) для того, щоб зв'язати групові антитіла, які можуть утворюватися в організмі у відповідь на вегетірованіе в ньому оральних або генітальних спирохет - сапрофітів. Потім абсорбована сироватка хворого поміщається на скло, на якому фіксована Т. pallidum. Якщо в сироватці хворого присутні специфічні антитіла до збудника сифілісу, вони зв'язуються з висушеними фіксованими спірохетами, а потім виявляються при додаванні меченного флюоресцеином антилюдського гамма-глобуліну і подальшому дослідженні препарату методом флюоресцентної мікроскопії. У реакціях гемаглютинації Т. pallidum (МНА-ТР, Натті, і ТРНА) також використовуються сорбентоподобние розведення для зв'язування групових антитіл до спирохетам. Специфічні антитіла до збудника сифілісу виявляються за допомогою аглютинації покритих Т. pallidum баранячих або індичих еритроцитів. Найбільш специфічним лабораторним тестом є тест іммобілізації збудника, при якому іммобілізація живих Т. pallidum здійснюється за допомогою імунної сироватки і комплементу. Однак ця реакція дуже трудомістка, а тому в США вона використовується тільки в науково-дослідних лабораторіях. Обидві реакції - гемаглютинації і FTA-ABS - дуже специфічні і в разі застосування їх для підтвердження позитивних результатів реагинового тесту високоефективні для діагностики сифілісу. Однак навіть ці реакції можуть давати від 1 до 2% ложноположітсльних результатів при масових скринінгових обстеженнях населення.
Відносна чутливість реакцій VDRL, FTA-ABS і МНА-ТР на різних стадіях перебігу сифілітичної інфекції відображена в табл. 122-2. Нетрепонемні реакції виявляються неефективними приблизно у 30% хворих на первинний або пізнім сифілісом. На ранніх стадіях первинного сифілісу максимального виявлення антитіл можна домогтися, або застосовуючи тест FTA-ABS, або просто повторюючи реакцію VRDL через кожні 1-2 тижнів, якщо результати первинної постановки цієї реакції були негативними. Однак результатів одного реагинового тесту недостатньо при підозрі на пізній симптоматичний сифіліс, в цьому випадку слід використовувати більш чутливий FTA-ABS-тест. При первинному сифілісі реакції гемаглютинації виявляються навіть менш чутливими, ніж реагінові тести, але при інших стадіях захворювання вони так само чутливі, як FTA-ABS. При вторинному сифілісі все нетрепонемні н трепонемні реакції досить чутливі, і негативний їх результат фактично виключає діагноз сифілісу у хворого з наявністю підозрілих осередків на шкірі і слизових оболонках (необхідно враховувати, що 1-2% хворих вторинним сифілісом не реагують або слабо реагують в реакції VDRL з нерозведеної сироваткою; при більш високих розведеннях можна отримати позитивний результат-феномен проагглютінаціонной зони - Прозона).
Хибно позитивні серологічні реакції на сифіліс. Так як антиген, який використовується в нетрепонемних реакціях, виявляється в інших тканинах, тести можуть давати позитивні результати у осіб, які не мають трепонемной інфекції, хоча титр в цьому випадку рідко перевищує 1: 8. Встановлено, що серед осіб, позитивно реагували на реагінові тести, від 20 до 40% дають хибнопозитивні реакції, однак цей про
Таблиця 122-1.Серологіческая діагностика сифілісу
Нетрепонемні (реагінові) реакції
Мікроскопічна флоккуляции: Науково-дослідна лабораторія венеричних хвороб (VDRL) Макроскопічна флоккуляции: швидкий сироватковий реагіни (RPR)
Імунофлюоресценція: флюоресцентная абсорбція антитіл до трепонема
(FTA-ABS) гемаглютинації: визначення гемаглютинації Т. pallidum (MHA-TP,
HATTS, ТРНА) Іммобілізація: іммобілізація Т. pallidum (TPI)
Таблиця 122-2. Ефективність серологічних діагностичних реакцій при нелеченом сифілісі
цент широко варіює залежно від складу обстежуваного населення. Серед населення, відібраного для скринінгу в зв'язку з наявністю схожих з сифілісом симптомів, наявністю в анамнезі вказівки на експозицію інфекції або знаходиться в групі підвищеного ризику по даній інфекції, відсоток хибнопозитивних результатів значно нижче. Хибно позитивні реагінові реакції класифікуються як гострі, якщо вони стали негативними протягом 6 міс. Гострі хибнопозитивні реагінові реакції спостерігаються при багатьох захворюваннях, таких як вірусні інфекції, мікоплазменние пневмонії і малярія, а також в результаті імунізації проти деяких інфекцій. Хронічні, реакції, що зберігаються протягом 6 і більше місяців, спостерігаються при наркоманії, аутоімунних захворюваннях і в літньому віці. Хибно позитивні реакції відзначаються у 25% наркоманів і у 10-20% хворих з активною системний червоний вовчак. У 15-45% осіб, які мають хронічні хибнопозитивні реакції, передбачається їх аутоімунний характер, обумовлений наявністю у хворих на системний червоний вовчак або інших захворювань сполучної тканини. До числа антитіл, з великою частотою виявляються в сироватці крові осіб з хибнопозитивними реакціями, відносяться антиядерні, антитиреоїдні і антимітохондріальні антитіла, а також ревматоїдний фактор і кріоглобуліни. Антитіла Доната-Ландштейнера, відповідальні за холодову пароксизмальную гемоглобулінурію, відносяться до гемолизинам, що виявляються при сифілісі. У міру збільшення віку частота хибнопозитивних реакцій зростає і в осіб старше 70 років 10% дають хибнопозитивні реакції на реагіни сифілісу. Інші захворювання, пов'язані з гіперглобулінемією, зокрема лепра, можуть також викликати хронічні хибнопозитивні реакції.
У хворих з хибнопозитивними реагінового реакціями діагноз сифілісу виключається при отриманні негативних результатів специфічних трепонемним тестів. Результати FTA-ABS-тесту зазвичай бувають негативними, сумнівними або позитивними. Сумнівні (прикордонні) результати спостерігаються головним чином у вагітних жінок або у осіб, які страждають хворобами, для яких характерний порушений або підвищений рівень глобулінів, що зазвичай не пов'язане з клінічними, анамнестичними або іншими серологічними ознаками сифілісу. Отже, сумнівні реакції слід завжди повторювати і інтерпретувати з особливою обережністю. Типові позитивні результати тесту FTA-ABS, як правило, свідчать про наявність сифілісу. Хоча хибнопозитивні результати FTA-ABS-тестів відзначені в 15% у хворих з активною системний червоний вовчак, флюоресцентная забарвлення при цьому в більшості випадків була сумнівною або атипової, виявляючи структури у формі вервиці. Цілком ймовірно, це пояснюється прикріпленням антиядерні антитіл до ДНК трепонеми або просочуванням нуклеопротеина через щілини в зовнішній мембрані мікроорганізму. Проте через імовірність лождоположітельних реакцій FTA-ABS тільки позитивні результати TPI вважаються доказовими щодо поточної або мала місце в минулому сифілітичної інфекції.
У практичних цілях більшість клініцистів повинні бути знайомі з трьома основними напрямками застосування серологічних реакцій на сифіліс: для тестування великої кількості сироваток з метою скринінгу або в діагностичних цілях (наприклад, RPR або VDRL); для кількісної оцінки титру реагінових антитіл з метою визначення клінічної активності сифілісу чи ефективності лікування (наприклад, VDRL або RPR); для підтвердження діагнозу сифілісу у хворих з позитивними результатами реагінових реакцій або з наявністю клінічної підозри на сифіліс (наприклад, FTA-ABS, MHA-TP, HATT).
Оцінка безсимптомного нейросифілісу. Безсимптомний залучення в процес центральної нервової системи виявляється при дослідженні цереброспінальної рідини (ЦСР). На стадії первинного сифілісу зміни складу ЦСР спостерігаються рідко, але при вторинному або прихованому сифілісі плеоцитоз або підвищення рівня протеїну виявляються у 40% хворих. При зараженні кроликів ЦСР, отриманої від хворих вторинним сифілісом, збудник виявляється в 40% проб, при прихованому сифілісі - значно рідше. Присутність блідої трепонеми в ЦСР часто супроводжується наявністю будь-яких інших змін в її складі, але в той же час мікроорганізм може бути виявлений і в пробах ЦСР від хворих без ознак плеоцитоза або підвищеного рівня білка. У допеніцілліновую еру ризик розвитку клінічно вираженого нейросифілісу в значній мірі корелював з інтенсивністю змін складу ЦСР на ранній стадії перебігу хвороби. Дослідження ЦСЖ слід рекомендувати всім хворим з позитивними серологічними реакціями і неврологічними ознаками або симптомами, а також хворим з нелікованим сифілісом невідомої тривалості або з сифілісом тривалістю більше 1 року. Можливість того, що безсимптомний нейросифіліс вже розвинувся у деяких хворих з вторинним або раннім прихованим захворюванням, не виключає цих рекомендацій. Через те що стандартна терапія, що проводиться з приводу раннього сифілісу, не дозволяє досягти в ЦСР бактерицидних для збудника концентрацій лікарських препаратів, деякі фахівці радять проводити при вторинному і ранньому прихованому сифілісі люмбальна пункція з подальшим тривалим наглядом тих хворих, у яких виявляються зміни складу ЦСР.
ЦСР досліджують на наявність плеоцитоза, підвищення рівня білка і реактивність в VDRL. Реакція ЦСР -VDRL високоспецифічні, якщо ЦСР не містить домішки крові. Однак ця реакція щодо нечутлива і може бути негативною навіть в разі прогресуючого симптоматичного нейросифилиса. Неабсорбованими FTA-тест, застосовуваний для дослідження ЦСР, значно частіше дає позитивні результати на всіх стадіях сифілісу, ніж VDRL, але може відображати пасивне проникнення сироваткових антитіл в
До спроб знайти більш чутливий і специфічний маркер для діагностики нейросифилиса відноситься олігоклональних зв'язування ЦСР і вимірювання продукції антітрепонемних IgM і IgG. У ЦСР, виділеної від 80% хворих множинним склерозом і приблизно від 40% хворих з іншими запальними захворюваннями ЦНС (нейросифіліс, бактеріальний менінгіт, вірусний енцефаліт, підгострий склерозуючий паненцефаліт), спостерігається дискретне олігоклональних зв'язування імуноглобуліну в області гамма-глобуліну під впливом електрофорезу ЦСР в агарозному гелі. Вважається, що ці антитіла продукуються інтратекально і володіють специфічністю щодо етіологічного агента (наприклад, Т. paiiidum при сифілісі і вірус кору при підгострому склерозуючому паненцефаліті). Однак тест олігоклональних зв'язування per se неснеціфічен для нейросифилиса у хворих з позитивними серологічними реакціями. Інтратекально продукція специфічних антисифилитической антитіл IgG і IgM встановлена різними методами, але це питання ще. н аходітся в стадії дослідження.