Метод титрування бактеріофага по Граціа

(На щільному живильному середовищі)

Поживний агар розливають в чашки Петрі і підсушують в термостаті. Готують напіврідкий поживний агар по 3-4 мл в пробірці і розтоплюють його на водяній бані. Роблять десятикратні розведення досліджуваного бактеріофага в фізіологічному розчині хлориду натрію. Потім 0,5 мл кожного розведення бактеріофага змішують з таким же об'ємом добової бульонной культури чутливих до бактеріофагу бактерій і виливають цю суміш в пробірку з напіврідким агаром температурою 45 ° C. Приготовану суміш швидко виливають на поверхню першого шару агару в чашці Петрі, де вона застигає у вигляді тонкого шару. Після застигання другого шару агару чашки інкубують при 37 ° C протягом доби. Суміші бактеріофага, культури і напіврідкого агару роблять з розведень фага 10 2 -10 10 в залежності від передбачуваного титру фага.

Чи не заражені бактериофагом бактерії, розмножуючись, утворюють суцільний газон зростання на поверхні поживного агару. Кожна інфікована бактериофагом бактерія лизируется і звільняє потомство бактеріофага, яке впроваджується в інтактні клітини бактерій, і весь цикл повторюється. В результаті лізису клітин на суцільному бактеріальному газоні з'являються «стерильні» плями або негативні колонії бактеріофага. Число цих плям відповідає кількості фагових частинок в засіяної суміші. Кількість пятнообразующіх одиниць в 1 мл вихідної суспензії бактеріофага називається його титром.

Метод фаготипирования має велике значення при епідеміологічних дослідженнях, так як дозволяє виявити джерело і шляхи поширення збудників захворювань. Визначення фаговаров виділеної чистої культури проводять за допомогою набору типових діагностичних бактеріофагів. Фаговар культури визначають по тому типовим фагу, який викликав її лізис.

Для проведення фаготипирования досліджувану добову культуру бактерій засівають «газоном» на поверхню поживного агару в чашки Петрі, підсушують в термостаті, ділять з боку дна чашки на квадрати і наносять піпеткою по одній краплі відповідного бактеріофага в тест-розведенні, зазначеному на ампулі. В один квадрат бактеріофаг не вносять для контролю росту культури. Чашку термостатируют при 37 о С 18-20 годин, після чого оцінюють результат реакції. Позитивний результат реакції фаголізису - лізис культури в місці нанесення бактеріофага ( «негативні» колонії) при наявності зростання в контролі свідчить про відповідність культури бактеріофагу і приналежності з урахуванням її фаголізабельність до відповідного виду.

Застосовувані на практиці препарати бактеріофагів є фільтрат бульонной культури відповідних мікробів, лу фагом, що містить живі частки фага, а також антигени бактерій, які звільнилися з бактеріальних клітин при їх лизисе. Отриманий препарат - рідкий бактеріофаг - повинен мати вигляд абсолютно прозорої рідини жовтого кольору більшою або меншою інтенсивністю. Препарат проходить контроль на стерильність (методом посіву), нешкідливість і політично активність (титр).

Діагностичні бактеріофаги випускаються як в рідкій, так і в сухій формі, в ампулах. Перед початком роботи сухий бактеріофаг розлучається.

Для лікувально-профілактичних цілей бактеріофаги випускаються у формі таблеток з кислотостійкої оболонкою, в рідкому вигляді або в супозиторіях. Таблетований сухий бактеріофаг більш стабільний при зберіганні і зручний при застосуванні. Одна таблетка сухого бактеріофага відповідає
20-25 мл рідкого препарату. Термін придатності сухого і рідкого препарату становить 1 рік. Рідкий бактеріофаг слід зберігати при температурі
+2 - +10 0 С, сухий - не вище +1 0 С, але його можна зберігати в холодильнику і при мінусовій температурі.

Прийнятий внутрішньо бактеріофаг зберігається в організмі протягом
5-7 днів. Як правило, прийом бактеріофага не супроводжується якими-небудь реакціями або ускладненнями. Протипоказань до прийому немає.

Бактеріофаги можуть застосовувати також у вигляді зрошень, полоскань, примочок, тампонів. Ін'єкційні форми бактеріофагів можна вводити в стерильні порожнини - черевну, плевральну, суглобову і в сечовий міхур. Існує форма випуску бактеріофагів в свічках для ректального застосування.

Дайте визначення поняття «антибіотики». Основні групи антибіотиків в залежності від способу отримання: природні, напівсинтетичні, синтетичні. Назвіть прізвище вченого, який розробив теорію хіміотерапії. Які властивості є визначальними при виборі хіміотерапевтичного препарату? Що таке хіміотерапевтичний індекс, напишіть його формулу, яким він повинен бути? Вкажіть перші антіспірохетозние препарати; перший антибактеріальний препарат і прізвище вченого, який отримав його. Назвіть прізвища російських вчених, вперше виявили антибактеріальні властивості зеленої цвілі. Назвіть прізвище вченого, що вивчав антибактеріальні властивості цвілевих грибів Penicillium і зробив спробу виділити пеніцилін. Вчені, що вперше отримали препарати пеніциліну. Продуценти антибіотиків - наведіть приклади. Класифікація антибіотиків за походженням, хімічним складом, по спектру дії. Механізм дії антибіотиків: мішені (точки прикладання антибіотиків різних груп). Типи дії - бактерицидну і бактеріостатичну; як в досвіді in vitro визначити їх? Противірусні антибіотики, механізми їх дії. Контроль антибіотиків на стерильність, нешкідливість, активність. Методи визначення активності антибіотиків. В яких одиницях вимірюється активність антибіотиків? Умови зберігання антибіотиків. Назвіть і охарактеризуйте можливі побічні явища при антибіотикотерапії. Дайте визначення поняття «лікарська стійкість мікробів». Види лікарської стійкості. Природна і придбана (первинна і вторинна). Генетичні механізми лікарської стійкості: хромосомная і плазмідна. Фенотипічні механізми лікарської стійкості - назвіть і охарактеризуйте. Раціональне застосування антибіотиків - назвіть способи. Назвіть препарати - інгібітори ферментів, що руйнують антибіотики. Опишіть методи визначення чутливості мікробів до антибіотиків.

Назвіть прізвища вчених, які відкрили явище бактеріофагії. Природа бактеріофага - до якого царству живих істот відноситься? Будова - яку форму найчастіше має, які хімічні компоненти містить; розміри - в яких одиницях вимірюється величина бактеріофагів? Опишіть фази взаємодії вирулентного бактеріофага з чутливою до нього бактеріальної клітиною. Як виявити дію бактеріофага на бактерії в рідкій і щільного поживного середовища? Як буде виглядати позитивний результат? Що таке титр бактеріофага? Як його визначають і позначають? Що таке помірний бактеріофаг. Опишіть взаємодія помірного бактеріофага з бактеріальною клітиною. Застосування бактеріофагів в практичній медицині, на якому властивості воно ґрунтується? Лікарські форми бактеріофагів, яким вимогам вони повинні відповідати? Умови зберігання. Наведіть приклади бактеріофагів, що застосовуються для лікування, для діагностики, для фаготипирования.

Завдання: на аптечному складі є препарати черевнотифозними бактеріофага: з титром 10 -7 і 10 -9. Який з цих препаратів буде більш активним? Чому?