Мета заняття: Ознайомитися з різними видами поживних середовищ, які використовуються в мікробіології. Навчитися готувати поживні середовища за прописами. Познайомитися з методами стерилізації поживних середовищ.
Матеріали та обладнання: хімічні реактиви, колби, скляні воронки, плитка, фільтрувальна папір, марля, ваги, прописи поживних середовищ, автоклав.
- Приготувати поживні середовища МПА, агар Чапека, крахмало-аміачний агар, картопляний агар, голодну середу, середовища для виділення різних груп мікроорганізмів.
- Зварити і профільтрувати середовища, підготувати їх до стерилізації в автоклаві.
- Познайомитися з методами стерилізації поживних середовищ.
- Простерилізувати середовища в автоклаві під керівництвом викладача.
Живильні середовища. Відомо дуже багато поживних середовищ для культивування мікроорганізмів (більше двох тисяч найменувань було класифіковано Левіним і Шёнлейном ще в 1930 г), але число інгредієнтів, які є їх невід'ємними компонентами, відносно невелика. Однак якісний діапазон цих середовищ досить широкий - від розчинів неорганічних солей, на яких можуть рости автотрофи, до складних поживних середовищ, які готуються з м'ясних гідролізатів, збагачених кров'ю або сироваткою; ними зазвичай користуються для виділення патогенних мікроорганізмів типу стрептококів, що відрізняються високою вимогливістю до складу живильного середовища. Розрізняють два основних типи поживних середовищ: так звані синтетичні середовища, головні складові частини яких точно відомі (наприклад, глюкозо-сольова живильне середовище), і емпірично підібрані живильні середовища природного походження, склад яких точно невідомий (до них відносяться пептони, що готуються з частково гідролізованого білка).
Вибір живильного середовища залежить в значній мірі від мети експерименту. Герберт наполегливо висловлювався за повсюдне використання синтетичних живильних середовищ. Однак слід визнати, що вони мають ряд практичних незручностей. Мікроорганізми, вирощені на таких поживних середовищах, зазвичай фенотипически відрізняються від вирощених на поживних середовищах природного походження типу бульйону (наприклад, за складом і за швидкістю ділення). Багато бактерій мають потребу у великій кількості факторів росту, і для деяких з них до цих пір не знайдені штучні середовища, на яких вони могли б розмножуватися. Можливо, що всі ці незручності її часом будуть подолані, але поки середовища невідомого складу типу бульйонів, приготованих з переварити, використовуються досить широко, хоча вони і вносять в експеримент неконтрольовані фактори.
До складу середовищ, що застосовуються для вирощування бактерій, входять необхідні для побудови білків цитоплазми органогени: азот, вуглець, водень, кисень, неорганічні сполуки, що містять фосфор, калій, сірку, натрій, магній, залізо, мікроелементи: кобальт, йод, марганець, бор , цинк, молібден, мідь і ін. Всі перераховані елементи повинні перебувати в живильному середовищі в удобоусвояемую для даного мікроорганізму з'єднанні, причому вимоги різних мікробів в цьому відношенні неоднакові. Потреба в кисні і водні бактерії задовольняють головним чином за рахунок надходить в клітку води. За характером засвоєння азоту мікроорганізми діляться наступним чином: одні з них витягають азот з простих амонійних сполук, інші потребують амінокислотах, треті розщеплюють високомолекулярні речовини - пептони, що є продуктами неповного ферментативного перетравлення білків. Строго паразитичні види бактерій розмножуються тільки в присутності нативного, т. Е. Незмінного, білка. Джерелом вуглецю для бактерій є головним чином різні вуглеводи: цукор, багатоатомні спирти, органічні кислоти і їх солі. Потреба бактерій в неорганічних елементах задовольняється додають до живильному середовищі солями: NaCI, KH2 P04. K2 HP04 і т. Д.
Мікроелементи, що виконують роль каталізаторів хімічних процесів, необхідні в мізерно малих кількостях і надходять в живильне середовище з пептоном, неорганічними солями і водою. Поряд з перерахованими органічними і неорганічними елементами бактерії потребують ростових факторах, які за своєю роллю відповідають вітамінів для тварин. Джерелом чинників зростання є прібавляеміе до живильному середовищі продукти рослинного і тваринного походження, що містять в своєму складі нікотинову, пантотенову, парабензойную кислоти, вітаміни. Живильні речовини можуть засвоюватися мікробами тільки при певній реакції живильного середовища, так як проникність оболонок мікробних клітин змінюється в залежності від рН середовища. Потреба в поживних речовинах і фізичних умовах у різних видів мікробів неоднакова і цим виключається можливість створення універсальної живильного середовища.
За консистенцією розрізняють щільні і рідкі поживні середовища. Щільні живильні середовища готують з; рідких поживних середовищ за допомогою додавання до них клейових речовин агару або желатину. Агар-агар (по-малайські желе) - продукт рослинного походження, що видобувається з морських водоростей. У воді агар-агар розчиняється при температурі 80-86 ° С, застудневающіе при 36-40 ° С. Застосування агарових середовищ завдяки їх здатності зберігати щільність при температурі 37 ° С дало можливість вирощувати мікробів при оптимальній для більшості з них температурі на щільних середовищах. Желатин - речовина білкової природи тваринного походження. У теплій воді при температурі 32-34 ° С він набухає і розчиняється, а при більш низькій температурі перетворюється в холодець. Однак при рН нижче 6,3 і вище 7,0 щільність желатину зменшується, і він погано застигає.
Вимоги, що пред'являються до живильних середовищ.
Живильні середовища повинні:
1. Утримувати необхідні для харчування мікроба поживні речовини.
2. Мати реакцію рН, оптимальну для вирощуваного виду мікроба.
3. Мати достатню вологість, так як мікроби харчуються за законами дифузії і осмосу.
4. Володіти Ізотонічність.
5. Бути стерильними, забезпечуючи тим самим можливість вирощування чистих культур бактерій.
Живильні середовища поділяються на середовища загального призначення та спеціальні.
До першої групи належать м'ясо-пептони: агар, бульйон, живильний желатин. Середовища загального призначення використовують для вирощування багатьох мікробів і застосовують в якості основи для приготування спеціальних середовищ, додаючи до них кров, цукор, молоко, сироватку і інші інгредієнти, необхідні для розмноження того чи іншого виду мікроба.
До спеціальних живильних середовищ відносяться елективні (виборчі) і диференційно-діагностичні.
Електівниє (виборчі) середовища. Принцип створення елективних поживних середовищ заснований на задоволенні основних біохімічних і енергетичних потреб того виду мікроба, для культивування якого вони призначені. Певний склад і концентрація поживних мікроелементів, ростових факторів при строгому значенні рН забезпечують оптимальні умови для вирощування одного або декількох видів мікроорганізмів. При посіві на них матеріалу, що містить суміш різних мікроорганізмів, раніше всього буде проявлятися зростання того виду, для якого дана середу буде елективної.
Диференційно-діагностичні середовища. Ці поживні середовища використовують для визначення видової приналежності досліджуваного мікроба, грунтуючись на особливостях його обміну речовин. За своїм призначенням диференційно-діагностичні поживні середовища поділяються наступним чином:
1. Середовища для виявлення протеолітичної і гемолітичної здатності мікробів, що містять в своєму складі білкові речовини: кров, молоко, желатин і т. П.
2. Середовища з індиферентними хімічними речовинами, які служать джерелом харчування для одних видів мікробів і не засвоюються іншими видами.
3. Середовища з вуглеводами і багатоатомних спиртами для виявлення відповідних ферментів.
4. Середовища для визначення редукуючої здатності мікробів.
До складу диференційно-діагностичних середовищ, призначених для виявлення сахаролитических і окислювально-відновних ферментів, вводять індикатори: нейтральну червону, метиленовий синій, лакмусовий настоянку, кислий фуксин, бромтимоловий синій, водний блакитний барвник і розоловой кислоту. Змінюючи своє забарвлення при різних значеннях рН, індикатор вказує на наявність або відсутність розщеплення, окислення або відновлення введеного в середу інгредієнта. Однак індикатор не є обов'язковою складовою частиною середовищ, призначених для виявлення ферментів. Так, наявність желатинази та інших протеолітичних ферментів в культурі визначають по розрідженню желатину, згорнутого яєчного або сироваткового білка.
Сухі поживні середовища. Приготування поживних середовищ - один з найбільш відповідальних ділянок роботи бактеріологічної лабораторії. У зв'язку з цим біопромишленності випускає стандартні, консервовані, сухі поживні середовища, різного призначення, для культивування мікроорганізмів. Готують середовища по прописи, зазначеної на етикетці. Сталість складу, стандартність середовища, простота і зручність в роботі, легкість транспортування і зберігання є великою перевагою сухих поживних середовищ. Після встановлення відповідного рН середу кип'ятять, фільтрують, освітлюють, розливають у флакони, пробірки і стерилізують. Слід враховувати, що після стерилізації середовище стає більш кислою.
Стерилізація живильних середовищ. Стерилізацію живильних середовищ здійснюють різними способами в залежності від тих інгредієнтів, які входять до їх складу.
1. Синтетичні середовища і все агарові середовища, що не містять в своєму складі нативного білка і вуглеводів, стерилізують 15-20 хв в автоклаві при температурі 115-120 ° С.
2. Середовища з вуглеводами і молоком (до складу якого входить лактоза), живильний желатин стерилізують текучим паром при температурі 100 ° С дрібно або в автоклаві при 112 ° С.
3. Середовища, до складу яких входять білкові речовини (сироватка крові), знепліднювати тиндалізація або фільтруванням.
4. Для стерилізації поживних середовищ, що містять в своєму складі нативні білки, користуються фільтрацією через мембранні фільтри Зейтца.
Підготовлені поживні середовища перевіряють на стерильність. Для цього їх ставлять в термостат при температурі 37 ° С. Середовища, простерилізовані в автоклаві, витримують в термостаті 1 добу, простерилізовані текучим паром - 3 діб.