Форма проведення лекції: лекція-консультація
1. Склад живильного середовища.
2. Стерилізація живильних середовищ.
1. У мікробіологічній практиці для вирощування микроорганиз-мов використовують різноманітні поживні середовища, які за складом поділяють на природні або натуральні напівсинтетичні і синтетичні середовища.
Живильні середовища бувають:
- синтетичні - вони складаються строго за регламентом тільки з чистих органічних і неорганічних речовин, тобто їх склад повністю відомий, застосовують тільки в лабораторіях;
- природні середовища - складаються з будь-яких відходів і напівпродуктів, виходять більш дешеві середовища, які застосовуються в промисловості;
- напівсинтетичні середовища - суміш перших і других.
Натуральні середовища складаються з продуктів тваринного і рости-ного походження - м'яса, молока, картоплі, моркви і т. Д.
Прикладами натуральних середовищ є:
- м'ясо-пептони бульйон, що складається з екстракту м'яса (500 г м'яса на 1 л води), 0,5% NaCl і 1% пептона (продуктів неповного раз-розкладання білка);
- неохмеленное пивне сусло, яку готують на основі солоду (про-що росли зерен ячменю), гидролизованного до cахаров;
- дріжджова середовище, що складається з екстракту дріжджів (7-10 г сухих дріжджів на 1 л води), до якого додають вуглеводи (1-2%), мі-Мінерали солі К2 НРО4 (0,1%) і NаСl (0,5% );
- картопляна середовище, яке готується шляхом відвару картоплі (200 г картоплі на 1 л води) і ін.
На натуральних середовищах добре розвиваються багато мікроорга-нізми, так як в таких середовищах є, як правило, всі компоненти, необхідні для їх росту.
Напівсинтетичні середовища в своєму складі поряд з сполуки-ми відомої хімічної природи містять речовини невизначеного складу.
До полусинтетическим середах відносять м'ясо-пептони бульйон з глюкозою і фосфорнокислим калієм, картопляну середу з глюкозою і пептоном, а також середовища відомого складу з добавкою різних фак-торів росту (гідролізату казеїну, дріжджового автолизата, кукурудзяного екстракту і т. Д.).
Синтетичні середовища - це середовища, до складу яких входять через відоме хімічні сполуки в певних концентраціях.
Наприклад, склад середовища Чапека для культивування грибів сле-дме: глюкоза - 30 г; азотнокислий натрій - 2 г; фосфорнокислий (однозаміщений) калій - 1 г; сірчанокислий магній - 0,5 г; хлористий, калій 0,5 г; сірчанокисле залізо - 0,01 г; вода - 1000 мл.
За призначенням розрізняють елективні та диференційно-диагно-стические (індикаторні) середовища.
Електівниє середовища забезпечують переважний розвиток одного виду або групи мікроорганізмів і менш придатні (або спів-всім непридатні) для розвитку інших.
Диференційно-діагностичні (індикаторні) середовища по-зволяют досить швидко відрізнити одні види мікроорганізмів від інших. Склад цих середовищ підбирають з таким розрахунком, щоб він позво-лив чітко виявити найбільш характерні властивості певного виду.
За фізичним станом розрізняють рідкі, щільні і уп-ність середовища.
Рідкі середовища застосовують для з'ясування фізіолого-біохімічних особливостей мікроорганізмів, для накопичення біомаси або продуктів метаболізму, а також підтримки і зберігання багатьох мікроорганізмів, погано розвиваються на щільних середовищах.
Сипучі середовища застосовують в промисловій мікробіології. До них відносяться, наприклад, розварене пшоно, висівки, кварцовий пісок, просочені живильним розчином.
Щільні середовища використовують для виділення чистих культур (напів-чення ізольованих колоній), діагностичних цілей (встановлення морфології колоній, особливостей росту на скошеному агарі і ін.), Для зберігання культур, кількісного обліку мікроорганізмів, визна-ділення їх антагоністичних властивостей і в ряді інших випадків.
Ущільнення середовищ здійснюють за допомогою агар-агар, желатин і кремнекислих гелю (силікагелю).
Найбільш часто в мікробіологічній практиці для ущільнення середовищ використовується агар-агар. Це складний полісахарид, одержуваний з морських водоростей. Більшість мікроорганізмів не використовують його в якості поживного субстрату.
У воді агар-агар утворює гелі, що плавляться при 100 ° С, затвердивши-вающие при температурі близько 40 ° С. Найчастіше агар-агар додають до середах в кількості 1,5-2%. Середу з внесеним в неї агаром нагрівають на киплячій водяній бані до повного розплавлення агару.
Менш широко використовується желатину - білок, що отримується при виварювання кісток і хрящів тварин. Желатину додають до жид-ким середах в кількості 10-15%. Утворений желатиновий гель пла-вітся при 23-26 ° С.
При спеціальних дослідженнях використовується кремнекислих гель (силікагель) - речовина неорганічної природи і його використовують як тверду основу для синтетичних середовищ.
До сировини для біотехнологічних виробництв пред'являють ряд вимог:
- воно повинно забезпечувати освіту необхідного продукту;
- середовище має бути доступною (для дешевих продуктів, а для дуже дорогих можна застосовувати дорогі середовища);
- живильне середовище повинна забезпечити легке виділення продукту;
- середовище має бути не токсичною і не забруднювати навколишнє середовище.
Біотехнологічна продукція становить мільйони тонн на рік, тому сировини потрібно багато. 90% сировини витрачається на виробництво спирту, а решта 10% - на всі біотехнологічні виробництва. Мікроорганізм може використовувати для життя будь-яку органічну сполуку, тому весь світовий запас органіки (рослини, грунт, хімікати) потенційно є їжею для мікроорганізмів.
Однак для того, щоб продуцент виробляв потрібний продукт, йому необхідно індивідуальне поживна з'єднання (живильне середовище).
Живильне середовище є складною трифазної системою і як би продовженням мікробної клітини.
Крім індивідуальних органічних сполук, в промисловості використовують різні відходи. Наприклад: 1 тонна кукурудзяного крохмалю варто 64-91 $, меляса - 140 $, етанол-430 $, глюкоза- 290 $, сахароза- 629 $.
Уся сировина можна розділити на кілька груп.
- углеродсодержащими сировину - глюкоза, сахароза, лактоза, крохмаль, спирти, органічні кислоти і т. д.
Глюкоза - С6 H12 O6 кристалічна, може містити води не більше 9%, золи - не більше 0,07%, (в тому числі не більше 0,004% заліза). У сухій речовині має бути не менше 99,5% редукуючих речовин.
Сахароза - (буряковий цукор, тростинний цукор) С12 H22 O11 технічна містить не менше 99,75% сахарози, не більше 0,003% золи. Вологість до 0,15%.
Лактоза - (молочний цукор) С12 H22 O11. одержувана з молочної сироватки, є відходом при виготовленні масла і сиру. Після згущення до концентрації цукрів 50% і кристалізації отримують концентрат лактози.
Лактозна цукор - сирець містить не менше 92% цукру, не більше 3% води, 2% золи і 1% молочної кислоти. Кількість білка не регламентоване, але зазвичай воно не перевищує 3%.
Метиловий спирт (метанол) CH3 OH є безбарвною, легкорухливою рідиною, по запаху нагадує етиловий спирт. Добре розчиняється у воді, легко засвоюється багатьма мікроорганізмами. Метиловий спирт може бути отриманий з природного газу, нафти, кам'яного вугілля. Перспектива використання метилового спирту в чому залежить від ефективності способу його отримання.
Слід пам'ятати, що метиловий спирт - сильна отрута для людини. Прийом всередину 30 мл метилового спирту смертельний.
Етиловий спирт (етанол) С2 H5 OH є перспективним сировиною для вирощування мікроорганізмів. Етиловий спирт добре змішується з водою, нетоксичний, одержувана на ньому біомаса не вимагає спеціального очищення. Як джерело вуглецю можуть використовуватися все марки етилового спирту, одержуваного як мікробіологічними, так і хімічним шляхом. У етиловому спирті допускається присутність незначних кількостей ізопропілового спирту, серусодержащих з'єднань, органічних кислот, складних ефірів, діетилового ефіру, нерозчинних у воді речовин.
До цієї ж групи належать різні відходи і побічні продукти: меляса, зернова і картопляна барда, кукурудзяна мука, мелассного барда, Ацетонобутилове барда.
У мелассного золі багато калію (30 - 40%), магнію (1,5 - 4,5%), кальцію (до 14%), заліза та інших елементів, але порівняно мало фосфору. При зберіганні меляси можуть мати місце втрати цукру в результаті діяльності мікроорганізмів.
Ацетонобутилове барда - нестандартний продукт, який є відходом мікробіологічного виробництва органічних розчинників - ацетону і бутилового спирту. Для мікробіологічного синтезу використовують барду після відділення шламу. У складі барди є вуглеводи, клітковина, азотсодержащие і зольні речовини.
- углеводородсодержащих сировину - це парафіни нафти, метан (сировину дешеве, і має постійний склад, що дуже добре для автоматизації процесів).
- до нетрадиційних джерел сирьяотносітся метанол, етанол і т. д.
Ці три групи - основний компонент живильного середовища тобто вуглецевмісний. Крім цього до складу живильного середовища повинні входити:
- джерела мінерального живлення (солі фосфору, азоту, натрію, калію, магнію, кальцію і т. д. містять АТФ);
- мікроелементи (цинк, марганець, молібден, кобальт, сірка і т. д.);
- комплексні збагачувачі середовищ. Вони містять біологічно активні речовини (БАР) - вітаміни, гормони, ферменти, фактори росту.
Ці речовини вводять не в чистому вигляді, а в складі якихось природних сумішей, наприклад: кукурудзяний екстракт, екстракт солодових паростків, дріжджовий автолізат і т. Д.
Основний принцип складання живильного середовища - це задоволення фізичних потреб мікроорганізмів.
Кожен конкретний мікробіологічний процес має свої особливості на стадії приготування поживних середовищ, і це пов'язано з застосовуваним в даному виробництві джерелом вуглецю.
Розчинні джерела вуглецю (наприклад, цукру) попередньо розчиняють у воді, доводячи розчини до певної концентрації в невеликих відкритих реакторах з мішалками, а потім подають в закритий реактор - змішувач з плоским дном, забезпечений для введення пара барботажний пристроєм.
Нерозчинні джерела вуглецю ретельно суспендують у воді в реакторі з мішалкою і переводять в суспензію в реакторі - змішувачі. Крохмаловмісну сировину попередньо клейстерізующімся.
Мінеральні солі розчиняють в реакторі з мішалкою, а перед подачею в реактор - змішувач фільтрують для видалення шламу (гіпс і інші нерозчинні опади). Розчин мікроелементів зазвичай готується окремо.
У реакторі - змішувачі всі подані в необхідних кількостях компоненти ретельно перемішуються, рН середовища доводиться до необхідного значення подачею аміачної води або кислоти. Реактори для приготування живильного середовища повинні бути забезпечені досить потужними мішалками, а також перегородками - відбивачами, що не допускають завихрення і обертання рідини. Залежно від складу використовуваної живильного середовища вибирають тип пристроями, як в апаратах для підготовки різних джерел вуглецю (розчинення цукру, розведення меляси, клейстеризація крохмалю і т. П.), Так і в самому реакторі - змішувачі для приготування живильного середовища.
2. Стерилізація - один з важливих і необхідних прийомів в мик-робіологіческой техніці. Слово «стерилізація» в перекладі з латин-ського (sterilis) означає знепліднювання. У мікробіології під стер-зацией розуміють загибель всіх живих мікроорганізмів. У Микробиол-ня практиці стерилізують живильні середовища, посуд, інструменти-менти та інші необхідні матеріали, щоб не допустити розвитку сторонньої мікрофлори.
Стерилізація живильних середовищ і посуду - обов'язковий момент в роботі при виконанні всіх завдань практикуму.
Існують різні методи стерилізації: фізичний, меха-ний і хімічний. Доцільність застосування кожного з них визначається особливостями матеріалу, що підлягає стерилізації, його фізичними властивостями, хімічним складом, метою дослідження.
Приготована в реакторі - змішувачі живильне середовище повинна бути піддана стерилізації. Для стерилізації поживних середовищ використовують два методи: при періодичному культивуванні - циклічний і при безперервному культивуванні - безперервний.
Циклічний метод стерилізації живильного середовища дуже простий. Це операцію можна здійснювати безпосередньо в ферментере. При цьому середовище і обладнання стерилізуються одночасно. Найчастіше використовують комбінований нагрівання гострим і глухим паром. Гострий пар подають в живильне середовище, а глухий - в сорочку (або змійовик). Гострий пар надходить в ферментер через штуцери для подачі посівного матеріалу, повітря і для взяття проб. Тому вся арматура, поєднана з ферментера, стерилізується проходять гострою парою.
Так як обробка живильного середовища гострою парою призводить до утворення конденсату, необхідно заздалегідь враховувати розведення середовища конденсатом і вносити відповідну поправку в рецептуру готується середовища. Тоді до кінця стерилізації середовище буде мати необхідну концентрацію всіх поживних компонентів.
При циклічної стерилізації підтримують температуру 121 о С, що відповідає тиску насиченої пари 100 кПа. Зазвичай поживні середовища витримують при такій температурі від 30 - 40 хв. Повний цикл нагрівання, витримки та охолодження для ферментеров великого обсягу досягає декількох годин.
Тривала теплова стерилізація призводить до певних хімічних змін в складі живильного середовища. Деякі нестійкі до нагрівання сполуки розкладаються, що призводить до втрати необхідних для мікроорганізмів поживних речовин. Інші сполуки можуть вступати у взаємодію між собою з утворенням продуктів, що пригнічують ріст мікроорганізмів. Більшість змін хімічних компонентів в складі живильного середовища може відбуватися при температурах, вищих, ніж температура стерилізації. Отже, ефективна стерилізація при мінімальній зміні складу середовища може бути досягнута застосуванням більш високої температури, швидким нагріванням і охолодженням середовища. Тому в даний час циклічний метод застосовують для стерилізації середовища тільки в апаратах малого обсягу.
Метод високотемпературної безперервної стерилізації, який використовується на більшості заводів, дає можливість звести до мінімуму погіршення поживних якостей середовища без зниження ефективності самої стерилізації.
При безперервної стерилізації можна значно скоротити час стерилізації, а, отже, знизити витрату пари. Крім того, цей вид стерилізації легко піддається автоматизації.
Для безперервної стерилізації приготована в окремій ємності живильне середовище насосом прокачується через установку в простерилізувати ферментер.
Застосування більш високих температур дозволяє різко скоротити тривалість витримування середовища при максимальній температурі, а періоди нагрівання і охолоджування здійснити за кілька секунд.
Якщо живильне середовище не містить суспендованих частинок, то температура 150 - 160 ° С забезпечує миттєву стерилізацію. При наявності твердих суспендованих частинок в середовищі оптимальна для стерилізації температура повинна бути нижче, так як вимагає більш тривалий час для прогрівання таких частинок. В даному випадку температура стерилізації складає 135 о С, а тривалість витримки - від 5 до 15 хвилин.
1.Загальна характеристика сировини для біотехнологічних виробництв.
2. Приготування і стерилізація поживних середовищ.
3. Основні вимоги та обмеження до сировини.
4. Основні компоненти живильного середовища.
5. Періодична або циклічна стерилізація.
6. Безперервна стерилізація
7. Принципи конструювання поживних середовищ
8. Основні види сировини і їх порівняльна характеристика