Секвенування - розшифровка послідовності ДНК.
а) секвенування по Сенгер;
в) секвенування наступного покоління;
г) напівпровідниковий секвенатор.
Полімерази, що використовуються при секвенування ДНК:
а) Фрагмент Кленова (ДНК-полімерази I з E.сoli) з відсутньою екзонуклеазной активністю, що розщеплює ДНК в напрямі 5-3. Фрагмент зберігає полимеразную і 3'-5 'екзонуклеазную активності.
б) Рекомбінантні ДНК-полімерази, що відповідають наступним вимогам: - відсутність 3'і 5'-екзонуклеазной активності,
- відсутність дискримінації щодо включення до зростаючу ланцюг як звичайних, так і модифікованих (мічених) ddNTP.
в) Термостабільні полімерази для секвенування:
-Thermo Sequenase ™, Amersham Pharmacia Biotech
- AmpliTaq FS ™, PE Biosystems
Секвенування по Сенгер:
1. «Плюс-мінус» метод, 1975
В якості матриці в реакції полимеразного копіювання використовувався одноланцюговий фрагмент ДНК, як праймерів - синтетичні олігонуклеотиди або природні субфрагмент, одержувані при гідролізі рестріцірующімі ендонуклеаза, а в якості ферменту - фрагмент Кленова ДНК полімерази I (PolI) з E.coli. Метод включав два етапи. Спочатку в обмежених умовах проводили полімеразну реакцію в присутності всіх чотирьох типів dNTP (один з них був мічений по альфа-положенню фосфату), отримуючи на виході набір продуктів неповного копіювання матричного фрагмента. Суміш очищали від незв'язаних дезоксинуклеозидтрифосфатов і ділили на вісім частин. Після чого в "плюс" системі проводили чотири реакції в присутності кожного з чотирьох типів нуклеотидів, а в "мінус" системі - без будь-якого з них. В результаті, в "мінус" системі термінація відбувалася перед dNTP даного типу, а в "плюс" системі - після нього. Отримані таким чином вісім зразків поділяли за допомогою електрофорезу, "зчитували" сигнал і визначали послідовність вихідної ДНК. Цим способом була секвенований коротка ДНК фага фХ174, що складається з 5386 нуклеотидних пар.
2. Метод «термінаторів», 1977
№22 Вчені в молекулярної біології
25 років керував лабораторією Колд-Спрінг-Харбор, де вів дослідження генетики раку.
У другій половині 1950-х років Крик намагався теоретично визначити механізм синтезу білка. До 1958 року він перерахував ключові особливості процесу синтезу білка:
- генетична інформація зберігається у вигляді молекул ДНК
- матрична РНК містить інформацію для створення одного білка
- Адапторная молекули (adaptor molecules) ставлять у відповідність фрагменти матричної РНК з амінокислотами майбутнього білка
- рибосоми-білкові комплекси (ribonucleic-protein complexes) каталізують збірку амінокислот в білок відповідно до матричної РНК
Крик вперше ввів термін «центральна догма» молекулярної біології (який використовується і сьогодні) для подання одностороннього переходу генетичної інформації за механізмом:
ДНК -> РНК -> білок ( «Інформація передається від нуклеїнових кислот до білка, але не в зворотному напрямку»).
3. Моріс Уілкінс
лауреат Нобелівської премії з фізіології і медицини 1962 (спільно з Джеймсом Уотсоном і Френсісом Криком) «за відкриття, що стосуються молекулярної структури нуклеїнових кислот і їх значення для передачі інформації в живій матерії». Вніс внесок у такі галузі наукового знання, як фосфоресценція, поділ ізотопів, оптична мікроскопія і рентгенівська дифракція, а також удосконалив радар. Моріс Уілкінс широко відомий завдяки роботі по визначенню структури ДНК в Королівському коледжі Лондонського університету
Головним напрямком наукової діяльності було вивчення хімічного складу і структури нуклеїнових кислот. Ервін Чаргафф визначив кількісний показник азотистих основ, що входять до їх складу. У 1950 - 1953 роках їм було показано, що загальна кількість аденінових залишків в кожній молекулі ДНК дорівнює кількості тимінових залишків, а кількість гуанінових залишків - кількості цитозинових. Правила Чаргаффа використовували Френсіс Крік і Джеймс Уотсон при визначенні структури ДНК у вигляді подвійної спіралі. Також Чаргафф довів, що ДНК володіє видовою специфічністю, і відкинув гіпотези про існування багатьох різновидів ДНК. Ервін Чаргафф був першим, хто почав досліджувати денатурацію ДНК. Крім того, він займався дослідженням згортання крові, вивчав ліпіди і ліпопротеїни і метаболізм амінокислот.
7. Роберт Холлей,
Холлей розділив Нобелівську премію з фізіології і медицині 1968 року з Харом Гобіндом Картою і Маршаллом Ніренбергом «за розшифровку генетичного коду і його ролі в синтезі білка
Лауреат Нобелівської премії з фізіології і медицині в 1968 році (спільно з Робертом Холлі і Харом Гобіндом Кораною) «за розшифровку генетичного коду і його ролі в синтезі білків»
У 1960 році до Ніренбергу спільно з Дж. Генріх Маттеї почав вивчення нуклеотидів. Ниренберг і Маттеї поза бактерії створили синтетичну молекулу РНК і експресували її в E.coli
Метод включає чотири компоненти: сегмент подвійної спіралі ДНК, званий темплатного ДНК, який слід копіювати, два олігонуклеотидних праймера (короткі відрізки односпіральной ДНК, кожен з яких комплементарний одному з коротких послідовностей темплатного ДНК), нуклеотиди - хімічні будівельні блоки, з яких будується молекула ДНК , і фермент полімераза, який копіює темплатного ДНК, приєднуючи до неї вільні нуклеотиди в правильній послідовності.
Ці інгредієнти нагрівають, що викликає роз'єднання подвійної спіралі темплатного ДНК на окремі спіралі. Суміш охолоджують, щоб праймери зв'язалися з комплементарними кінцями відрізків темплатного ланцюгів. Потім полімераза починає копіювати темплатного відрізки приєднанням нуклеотидів на один з кінців праймерів і в підсумку виробляючи подвійну спіраль ДНК.
Повторення циклу збільшує кількість ДНК по експоненті: кожні 30 циклів, що займає всього кілька хвилин, дають більше мільярда копій вихідної послідовності ДНК.
У 1960 Сміт перейшов в Інститут досліджень ферментів при університеті Вісконсіна, де працював над синтезом олігорібонуклеотідов, найгострішою в той час хімічної проблемою в області нуклеїнових кислот.
Першим розробив метод спрямованого мутагенезу на початку 1970-х і кілька років його вдосконалював. У 1978 Сміт і його співробітники досягли перших успіхів в направленому мутагенезі молекули ДНК бактеріофага, а в 1982 вони вже змогли виробляти великі кількості ферменту, в якому за допомогою свого методу замінювали будь-яку обрану амінокислоту в амінокислотноїпослідовності ферменту.
2) RAPD (random amplified polymorphic DNA; ампліфіціруемого ДНК фрагменти) - метод ампліфікації ДНК сегментів з використанням випадкових праймерів (приблизно 10 нуклеотидів) не вимагає попереднього знання послідовності ДНК, проте внаслідок стохастичною природи ДНК ампліфікації важлива оптимізація і підтримка відповідних умов для отримання відтворюваних результатів . Метод використовується, наприклад, для вивчення близькоспоріднених видів і молекулярної ідентичності рослин, що розмножуються in vitro [13, 14, 15]. Недоліками методу є: домінантність, не дуже гарна відтворюваність і необхідність високоочищеної неконтамінірованной ДНК, оскільки використання коротких випадкових праймерів може призводити до ампліфікації фрагментів різних організмів; локус-неспецифичность маркерів і негомологічних фрагментів однакового розміру (homoplasy). Внаслідок недостатньої воспроізводміості RAPDs складно використовувати в міжлабораторних дослідженнях. Внаслідок вищезазначеного значимість отриманих результатів та їх інтерпретація можуть піддаватися сумніву.
4) AFLP (amplified fragment length polymorphism; ампліфікація поліморфних по довжині фрагментів ДНК) - метод селективної ПЛР ампліфікації поліморфних по довжині фрагментів, отриманих в результаті ензиматичного розщеплення геномної ДНК ендонуклеаза рестрикції. До отриманих після рестрикції фрагментами для селективної ампліфікації «пришиваються» олігонуклеотидних адаптери. Таким чином, праймери складаються з адаптера і послідовності декількох нуклеотидів (1-5), специфічних для впізнавання ферментом рестрикції. Поліморфізм фрагментів по довжині (зазвичай кілька десятків на реакцію), обумовлений безліччю геномних сайтів рестрикції, виявляється при електрофорезі. Відтворюваність і високу кількість інформативних фрагментів в реакції дозволяє використовувати метод в різних аспектах: вивчення генетичної ідентичності, ідентифікація сортів і клонів, філогенетичні зв'язки, картування, MAS і ін. Реалізація методу вимагає високої якості ДНК. Хоча використання AFLPs, як і RAPDs, не вимагає попереднього знання ДНК послідовностей, ці типи маркерів складно використовувати при вивченні різних популяцій або навіть видів. Недоліками AFLPs є домінантність алелей, можлива негомологічних однакових по довжині фрагментів - гомоплазія. У разі вставки між сусідніми місцями рестрикції спостерігається втрата короткого фрагмента і поява більш довгого. При використанні домінантних маркерів, наприклад, в диплоидов один бенд має місце у випадках, якщо одна або обидві гомологічні хромосоми містять ампліфіціруемого послідовність, тобто неможливо розрізнити гомо- і гетерозиготи. У полиплоидией неясність посилюється, оскільки навіть в разі виявлення певного бенду тим більше важко сказати, в якій кількості аллель присутній [22]. Тим не менше, використання AFLP маркерів протягом останнього десятиліття (PubMed) практично не знижувався. Метод використовується при вивченні еволюційних і екологічних аспектів живих організмів, при збереженні видів.