Молекулярні вектори, що використовуються в генетичній інженерії - все цікаве і актуальні

Вектор (англ. Vector) - це «переносник інфекції». Дане поняття застосовується в різноманітних випадках. Приклади векторів з різних областей біології:

1) комахи виступають як вектори патогенних мікроорганізмів і вірусів, що викликають хвороби хребетних тварин;

2) комаха з роду Sire.х - це вектор, який переносить пропагул базідіанального гриба Aniylostereum, що викликає гниль стовбура хвойних дерев.

Молекулярний вектор - це молекула ДНК, в яку можлива вмонтовувані фрагмента чужорідної ДНК. Вона здатна переносити даний фрагмент в своєму складі в реціпіентние клітини, самостійно реплицироваться і стабільно підтримуватися в реципієнтних клітинах, або вбудовуватися в геном господаря і також стабільно в ньому підтримуватися.

За іншим визначенням, молекулярні вектори - це гібридні молекули ДНК, що несуть штучно вбудований фрагмент, що представляє той чи інший інтерес, і здатні ампліфікувати (розмножуватися) в живих клітинах окремо від основного генома господаря або вбудовуватися в нього.

Загальні уявлення про нуклеїнові кислоти

ДНК - це біологічний гетерополімер. У звичайному стані первинна структура ДНК являє собою подвійну спіраль, що складається з двох довгих полімерів, закручених навколо загальної осі. Ширина спіралі становить 2-2,6 нм. Дві ланцюга ДНК, що утворюють спіраль, за своєю хімічною структурою є антипаралельними, тобто орієнтовані в протилежні сторони. У живій клітині спіраль утворює компактізірованную структуру, в якій ДНК намотана на хроматіновие білки або гістони. Остов ДНК утворений сахарофосфатнимі групами, з'єднаними складноефірний зв'язку. Сахарид, що входить до складу ДНК, є пентози, тобто 5-вуглецевим цукром.

Одиниці або мономери ДНК - це нуклеотиди.

Підстава, поєднане з сахаридами, утворює нуклеозид, а нуклеозид, з'єднаний із залишком фосфорної кислоти в позиції пентозного кільця 5 ', утворює нуклеотид.

В результаті реплікації утворюється дві ідентичні копії подвійний спіралізірованной молекули ДНК.

Кінець молекули, на якому є вільна гідроксильна група, яка перебуває в позиції 3 'пентозного кільця, називається три-штрих, або три-прим кінцем. Протилежний кінець, на якому є залишок фосфорної кислоти, приєднаний до вуглецевого атома 5 'дезоксирибози, називається п'ять-штрих, або п'ять-прим кінцем.

У рибонуклеїнової кислоти (РНК) в остов молекули входить сахарид рибоза, у якого, на відміну від дезоксирибози, в позиції 2 'пентозного кільця є гідроксильна угруповання.

Підстави в складі ДНК діляться на пуринів і піримідинів. Пуринові основи мають 2 кільця, що складаються з атомів C та N, а піримідинів - одне кільце. До пуринів належать аденін і гуанін, до піримідиніл - цитозин і тимін, а також уроці, який замінює тимін в РНК.

Метилирование - це спосіб модифікації нуклеотидів в живих системах. НДНК «схлопиваются» подібно застібці-блискавки. Матричні процеси і центральна догма молекулярної біології Центральна догма молекулярної біології описує шлях передачі генетичної інформації в клітині по генеральну схему ДНК / матрична ГНК / білок. Матрична РНК (мРНК) називається ще месенджер-PHК. Главниаіболее поширений приклад метилування - це 5-метілцітозін. У подвійній молекулі ДНК нуклеотиди утворюють компліментарні (взаємодоповнюючі) пари пурини-піримідинів, об'єднані водневими зв'язками. Між А і Т утворюється 2 водневі зв'язку, між G і С - 3. З цієї причини пари G-С пов'язані міцніше.

У векторних системах ДНК використовується як в одноцепочечной. так і двухцепочечной формі. Одна з ланцюгів, що кодує білок, називається смисловий, а компліментарна їй - антисмислової.

При температурі 90-95 градусів водневі зв'язку між нитками ДНК рвуться, і двунітевая ДНК розділяється на дві однонітевиє молекули. Цей процес називається денатурацією, або плавленням. Якщо молекули знаходяться в розчині, то при зниженні температури вони асоціюються знову, завдяки компліментарних взаємодій між нуклеотидами. Цей процес називають гібридизацією. При цьому нитки ДНК «схлопиваются» подібно застібці-блискавки. Матричні процеси і центральна догма молекулярної біології Центральна догма молекулярної біології описує шлях передачі генетичної інформації в клітині по генеральну схему ДНК / матрична ГНК / білок.

Матрична РНК (мРНК) називається ще месенджер-PHК.

Головними шляхами передачі генетичної інформації є:

- ДНК - ДНК (реплікація ДНК);

- ДНК> мРНК (транскрипція у прокаріот);

- ДНК - пре-мРНК - зріла мРНК (транскрипція і дозрівання РНК);

- мРНК - білок (трансляція).

Спеціальні шляху передачі інформації:

- мРНК - ДНК (зворотна транскрипція, для РНК-вірусів або ретровірусів);

- РНК - РНК (реплікація РНК).

Реплікація ДНК у про- і еукаріот йде за допомогою набору спеціальних ферментів. Найголовніші з них - ДНК-полімерази, які добудовують компліментарну ланцюг на основі одноцепочечной молекули, використовуючи вільні мононуклеотиди в якості будівельних блоків.

Транскрипція відбувається за участю ферменту транскриптази. Транскрипція і дозрівання мРНК у еукаріот відбуваються в клітинному ядрі, зокрема на молекулярних машинах біосинтезу білка - рибосомах.

Експресія гена - це процес, при якому закладена в гені інформація використовується для синтезу функціонального продукту. Функціональним продуктом може бути:

2) рибосомальная РНК;

3) трінспортная РНК;

4) мала ядерна РНК.

Останній з видів РНК бере участь в сплайсинге і в процесі формування рРНК. У разі застосування векторів найбільший практичний інтерес представляє експресія білок-кодує гена.

Функції і найголовніші типи векторів

Передумови розробки і застосування молекулярних векторів в генної інженерії і біотехнології.

1. Відкриття нуклеїнових кислот і генетичного коду;

2. Відкриття позахромосомних елементів у про- і еукаріот - плазмід;

3. Відкриття вірусів і особливо механізмів вбудовування вірусної ДНК в геном господаря;

4. Розробка методів виділення високоочищених препаратів непошкоджених плазмід і неушкодженою ДНК вірусів;

5. Розкриття механізмів проникнення чужорідної ДНК в клітини;

6. Відкриття ферментів, що забезпечують реплікацію і модифікацію ДНК.

Призначення векторів:

У фундаментальній науці вектори служать для вивчення окремих генів і цілих геномів шляхом їх клонування і подальшого сиквенсу, для вивчення функцій генів і молекулярних механізмів їх експресії. В інженерії вектори використовуються з метою створення генно-модифікованих організмів продуцентів.

Найголовніші типи векторів (за призначенням):

  1. Клонуючі вектори - служать для напрацювання великої кількості копій вбудованого фрагмента ДНК (наприклад, з метою його подальшого сиквенсу - розшифровки послідовності);
  2. Експресують вектори - служать для отримання чужорідного білка в організмі-хазяїні (організмі-продуцента); вектори, що забезпечують правильну і ефективну експресію чужорідних генів в клітинах. Вбудований в вектор ген не тільки амплифицируют, але на його основі відбувається утворення мРНК і потім білків. Експресують вектори використовуються для створення штамів мікроорганізмів, які продукують чужорідний білок в підвищених кількостях.
  3. Націлені вектори - служать для введення дефектного гена в геном досліджуваного oрганізмa з метою виявлення фенотипічного прояву генів. Вектор, який використовується для інактивації будь-якого гена при генетичних дослідженнях певних організмів, називають націленим.

По поведінці щодо генома господаря вектори ділять на інтегративні і неінтегратівние. Якщо вектор забезпечує встройку чужорідної ДНК в геном клітини, то він називається інтегративним.

Молекулярний вектор повинен володіти:

1) ділянкою, визначальним початок реплікації;

2) сайтом для вбудовування чужорідної ДНК;

3) селективним маркером.

Необхідні властивості клонують векторів:

1) вектор повинен нести нуклеотидную послідовність, яка відповідає за автономну реплікацію даної молекули в певному типі клітин;

2) не повинен втрачати реплікативних властивостей навіть при встройке чужорідного фрагмента ДНК;

3) повинен мати якомога мале число місць розщеплення певної рестриктазой, краще один сайт або локус рестрикції;

4) повинен містити 1 або кілька генетичних маркерів, за яким може бути проведений відбір клоном, тобто якщо вектор успішно увійшов в клітку, цю клітку необхідно відібрати по добре помітному ознакою і розмножити, а потім провести молекулярне клонування;

5) повинен реплицироваться з утворенням підвищеного числа копій в клітці.