У напівнеперервних системах повне завантаження і розвантаження ферментера здійснюються одноразово, однак у процесі росту культури частина її зливається, а звільнився обсяг заливається свіжою живильним середовищем, тобто функціонує відокремлений-доливной або сливно-доливной система.
Отже, Напівбезперервне культивування характеризується частотою і обсягом зливається виросла культури і додаванням свіжої живильного середовища в робочу ємність ферментера.
Сталі режими полунепреривного культивування характеризуються коливанням концентрації мікроорганізмів близько однієї ітой ж постійної велічіниі відносною сталістю середньої питомої швидкості росту популяції.
Напівбезперервне культивування мікроорганізмів здійснюється у відкритій динамічної гомогенної одностадійної системі в будь-якому ферментере для періодичного культивування, оснащеному системою перемішування і аерації.
Різні варіанти напівнеперервних систем використовуються у виробництві дріжджів, водоростей, антибіотиків, лимонної кислоти та інших.
Переваги періодичних і напівнеперервних процесів
Мінімальна ціна апарату і системи управління.
Гнучкість - можливість напрацювання в одному біореакторі різних продуктів.
Час культивування можна довільно змінювати.
Процес менше схильний до контамінації і мутацій клітин через відсутність протоки і щодо малого часу процесу.
Процес зручний для отримання малої кількості продукту.
Умови культивування можна підтримувати в оптимумі як у фазі росту біомаси, так і у фазі біосинтезу продукту, причому оптимальні умови для біомаси та продукту можуть бути різні.
Процес зручний для реалізації біосинтезу вторинних метаболітів.
Недоліки періодичних і напівнеперервних процесів
Необхідність частого приготування посівного матеріалу.
Велике непродуктивне час процесу.
У зв'язку з необхідністю частої стерилізації швидше зношуються вимірювальні прилади (датчики рН).
Продуктивність по біомасі та цільовим продукту часто нижче, ніж в безперервних процесах.
Важче підтримувати необхідні параметри.
Процес більш небезпечний для людини (апарат частіше відкривають, миють, що пов'язане з контактом з мікроорганізмами і продуктами їх життєдіяльності).
На відміну від періодичного культивування в безперервних процесах живильне середовище подається безперервно, видалення біомаси і продуктів її життєдіяльності також здійснюється безперервно.
За таким принципом організовуються 2 різновиди процесів безперервного культивування: процеси повного (ідеального) змішання, або хемостатного процеси, і процеси повного витіснення, або тубулярні процеси.
Сталі режими безперервного культивування характеризуються постійного-ством концентрації мікроорганізмів і питомої швидкості росту популяції.
Безперервне культивування проводиться у відкритій динамічній системі, яка може бути як гомогенної, так і гетерогенної. Ця система здатна до тривалої роботи в постійному сталому режимі.
Хемостатного процеси безперервного культивування
Гомогенні системи ідеального змішування
Будь-періодичний процес можна перевести в безперервно-проточний. Безперервно-проточное культивування відкриває можливості для підтримки постійних умов зростання шляхом створення такого складу живильного середовища, щоб тільки один бажаний фактор лімітував зростання. Якщо в такому процесі щільність популяції визначається хімічним складом середовища (концентрацією лімітує зростання фактора), його називають хемостатного культивуванням.
Змінюючи концентрацію лімітує зростання фактора, можна змінювати щільність популяції, тобто змінюючи швидкість розведення, можна отримувати режими, що забезпечують різну швидкість росту популяції. При такому методі, регулюючи швидкість протоки, можна відтворити будь-яку точку росту періодичної культури.
При такому способі культивування можна отримати стійкого стану тільки при максимальній швидкості росту. У хемостате практично можна тільки наблизитися до максимальної питомої швидкості росту, але не досягти її, тому що така швидкість росту відповідає критичної швидкості розведення, при якій біомаса вимивається з ферментера. що є одним з істотних недоліків Хемостат.
Для боротьби з цим явищем можливо використовувати комплекс «ферментер-сепаратор». У цьому комплексі виходить з ферментера рідина згущується на сепараторі, і частина згущеного потоку безперервно повертається в ферментер, інша частина йде як товарний продукт. Освітлена рідина скидається в стоки. Основними напрямками використання реціпкуляціі є: підвищення продуктивності системи безперервного культивування і більш повне споживання субстрату з середовища.
Одностадійний Хемостат застосовується при необхідності відтворити на протоці будь-яку швидкість росту клітин, крім максимальної.
Двостадійний Хемостат дозволяє створювати культури при швидкості росту, близькій до максимальної, і визначати умови її підвищення. Для цього в першому ферментере ведеться культивування при швидкості розведення, меншою ніж питома швидкість росту, а в другій подається культура з першого.
Особливості двухстадийного Хемостат:
1. вимивання культури в другому ферментере не відбувається через безперервне надходження культури з першого. Отже, концентрація біомаси ніколи не зможе стати рівною нулю при будь-якій швидкості розведення. Буде зростати питома швидкість росту клітин і економічний коефіцієнт.
2. Концентрація субстрату в другому апараті завжди менше, ніж в першому. Субстрат витрачається із запасу вхідного потоку. Це має значення в тих випадках, коли важливий не тільки вихід біомаси, а й її чистота.
3. Концентрація біомаси в другому апараті завжди вище, ніж в першому (враховується приріст біомаси).
4. Двостадійний Хемостат часто виявляється зручніше для тих процесів, в яких цільовим продуктом є не біомаса, а метаболіти.
Турбідостат. У ньому подача живильного середовища здійснюється по команді фотоелектричного елемента, який реєструє оптичну щільність культури. Швидкість розведення сама встановлюється відповідно до заданої щільністю популяції. Цим турбідостат відрізняється від Хемостат, в якому фіксується швидкість розведення, відповідно до якої встановлюється концентрація біомаси.
Хоча теоретично взаємозв'язок між концентрацією біомаси і швидкістю розбавлення підпорядковується одним і тим же закономірностям в хемостате і турбідостате, методи управління процесами різні. Турбідостат дозволяє отримувати максимальні швидкості росту, які застосовуються при культивуванні клітинних культур, фіксованих в стадії експоненціального зростання. Хемостат ж застосовують при швидкостях розведення від найнижчої до тільки наближається до максимальної питомої швидкості росту.
В даний час розроблені різні варіанти безперервного культивування мікроорганізмів, що працюють за принципом турбідостата - pH-стат, оксістат, СО2-стат, теплостат, респіростат, віскозістат і т. Д. Назви яких відповідають задається параметром. Будь-параметр, який змінюється в періодичній культурі і на який існує датчик, може бути використаний для управління ростом за типом турбідостата.
Особливості отримання та підтримки культивованих ліній тварин клітин.
Клітин тварин
Ідея про те, що клітини тканин тварин можна виділити з організму і потім створити умови для зростання і відтворення їх in vitro. виникла на базі концепції, що належить К. Бернару.
Трохи пізніше, в 1885 р Ру показав можливість збереження поза організмом живих тканин на практиці. Він протягом кількох днів підтримував в життєздатному стані нервову пластинку курячого ембріона в теплому сольовому (фізіологічному) розчині.
В цей же період був розроблений дуже суттєвий підхід в техніці роботи з клітинами - тріпсінізаціі - для вивільнення клітин з тканинної матриці. Вперше клони клітин в культурі з одиночної клітини були отримані Ерлом з співробітниками в 1948 р
Перші суспензійні культури клітин тварин, отримані в 1953 р Оуенсом і співробітниками. грунтувалися на клітинах злоякісних тканин. Це - клітини HeLa. виділені з ракової пухлини шийки матки человекаІгл (1955) систематично досліджував харчові потреби клітин людини і миші.
До тих пір, поки у 1961 р Хейфлик іМурхед не виділили лінію диплоїдних клітин людини (НDС) WI-38. вважалося, що один раз встановилася клітинна лінія має необмежений час життя. Щодо лінії WI-38 було показано, що період її існування в культурі обмежується приблизно 50 генераціями. Перед відмиранням популяції для клітин цієї лінії характерний феномен старіння. Однак при відмирання ці клітини залишалися диплоїдними і не мали ознак злоякісних змін.
Межа, іліліміт, Хейфліка - межа кількості поділів соматичних клітин. Ця межа була знайдена в культурах всіх повністю диференційованих клітин людини та інших тварин. Максимальне число поділок по-різному в залежності від типу клітин і ще сильніше розрізняється залежно від організму. Для більшості людських клітин межа Хейфліка становить 52 ділення.
Наступний етап в історії культивування диплоїдних клітин людини пов'язаний з встановленням факту, що вони є генетично стабільними і вільними від всіх відомих латентних і онкогенних вірусів. Тому лінії диплоїдних клітин людини дозволено застосовувати для отримання продуктів, що призначаються для людей. Ця догма залишається чинною і в даний час, хоча подальші дослідження чітко показали присутність в клітинах, виділених з нормальних тканин, потенційних онкогенів, ідентичних тим, які знайдені в таких відомих онкогенних вірусах, як вірус саркоми Рауса і вірус саркоми Молоні.
В даний час практично будь-які клітини людини і тварин можуть бути введені в культуру і, тим самим, служити засобом і об'єктом в багатьох дослідженнях. Завдяки культивування клітин можливості дослідження і діагностики розширюються майже безмежно, тому що є можливість оцінки не тільки морфологічних і біохімічних змін, але і змін в поведінці клітин, їх реакції на різні агенти, в тому числі і на лікарські впливу.
Найбільш часто культивуються такі елементи:
сполучної тканини - фібробласти;
скелетної - кістка і хрящі;
м'язової - скелетні, серцеві та гладкі м'язи;
епітеліальної - печінку, легені, шкіра, сечовий міхур, нирки, молочна залоза;
нервової - гліальні клітини і нейрони (хоча вони позбавлені здатності до проліферації);
ендокринної системи - гіпофіз, надниркові залози, клітини острівців Лангерганса;
різні типи пухлинних клітин.