В основі молекулярного клонування лежить вбудовування потрібного фрагмента ДНК в іншу молекулу ДНК, яка здатна реплицироваться (інформація, закодована в послідовності підстав батьківської ДНК, передається з точністю дочірньої ДНК) у відповідній клітині-хазяїні. Молекули ДНК, які використовуються для перенесення вбудованого матеріалу в бактеріальні клітини, називають векторами. Таке вбудовування здійснюється in vitro, а потім отримані рекомбінантні ДНК вводять в клітини.
Векторна молекула неодмінно повинна містити точку початку реплікації - ori. Крім того, для реплікації необхідні специфічні ферменти і допоміжні білкові фактори. Їх джерелом є клітина-господар або вони кодуються самим вектором. Вектором може бути будь-який невеликий позахромосомних елемент - плазміда, ДНК фага або ДНК-вірусу, косміди, фазміди.
Найбільш широко застосовуються такі комбінації, коли в ролі господаря виступає штам E. coli К12, а в ролі вектора - плазміди і різні фаги E. coli. Переважне використання цього штаму обумовлено тим, що саме в клітинах E. coli К12 безперешкодно реплицируются багато бактеріофаги і плазміди, які можуть бути використані в якості потенційно корисних векторів, і цей штам найбільш вивчений.
Классіфікаціруют плазміди в зав-ти від наявності в них модульних сегментів ДНК. Кожен модульний сегмент може містити один або кілька генів, або цис-дія елементів таких, як, наприклад, локус ori. Кожна плазмида повинна мати принаймні один реплікаційний модуль, який дозволить їй активно розмножуватися в реципієнтную клітці. Наявність інших модулів, відмінних від Реплікаційний, не є обов'язковим для кожної плазміди.
Статеві чинники, звані коньюгатівнимі плазмидами. (Наприклад F-плазміда) мають модулі кон'югації, що містять гени і регуляторні області, необхідні для перенесення плазміди з однієї клітини в іншу. Деякі з неконьюгатівних плазмід (без модуля коньюгации) можуть бути перенесені з однієї клітини в іншу, якщо вони поєднані в донорной клітці з статевим фактором.
Модулі іншого типу містять гени, білкові продукти яких забезпечують інактивацію антибіотиків. Плазміди, що несуть такі модулі, часто називають R-плазмідами (від англ. Resistance - стійкість). Нерідко одна плазмида надає стійкість до кількох антибіотиків, при цьому кілька або навіть всі гени резистентності різного типу можуть бути згруповані в одному модулі.
Є ще один тип модулів, що зустрічається в складі як коньюгатівних, так і неконьюгатівних плазмід - це col- модулі. Col -модулем є гени, що кодують один з декількох білків - коліцінов - антибактеріальних агентів, які продукуються бактеріями. Коліціни відрізняються за структурою і механізмом дії. Дуже часто col- плазміди, що кодують певний коліціни, містять гени, що забезпечують імунітет до цього коліціни, захищаючи таким чином клітку-продуцент від пошкоджень, що викликаються її власним коштом захисту.
Плазміди, початково виявлені в природі, були згодом модифіковані, вкорочені, реконструйовані і піддані рекомбінації як in vivo, так і в умовах in vitro. Метою всіх цих маніпуляцій було отримання універсальних плазмід або, навпаки, плазмід, призначених для вирішення якихось конкретних експериментальних задач. Кращі з них містили генетичні маркери, що дозволяють спростити відбір тих бактеріальних клітин, які включали рекомбінантні молекули.
Крім того, що генетичні маркери дозволяють виділяти клони бактеріальних клітин, що містять рекомбінантний плазмиду, вони виконують ще одну важливу функцію. Якщо плазмида в певних умовах не виконує свою функцію, то клітини зазвичай ростуть і розмножуються більш ефективно під час відсутності «зайвої» позахромосомних ДНК. Тому ті клітини, які втрачають плазмиду швидко переростають інші, при цьому рекомбінанти елімінуються. В іншому випадку, якщо клітини знаходяться в таких умовах, коли їх життєздатність залежить від плазміди, елімінуються клітини втратили вектор.
Властивості ідеального плазмідної вектора. Ідеальний плазмідний вектор для молекулярного клонування повинен відповідати таким вимогам:
1. вектор повинен містити мінімальну кількість ДНК;
2. реплікація вектора повинна регулюватися за типом ослабленого - (що призводить до появи в клітині багатьох копій плазмід), а не суворого контролю, щоб забезпечити високий вихід ДНК;
3. вектор повинен містити не менше двох селективних маркерів і мати один сайт впізнавання для рестріктірующей ендонуклеази. Остання властивість дозволяє розрізати кільцеву ДНК в унікальному сайті, за яким згодом здійснюють лігування зі вставкою;
4. для максимально простого відбору трансформантов, унікальний сайт рестрикції повинен розташовуватися в межах одного з двох селективних маркерів;
5. вставка не повинна переривати послідовність, необхідну для збереження самої плазміди.
З усіх векторів при роботі з E. coli найбільшою популярністю користується плазмида pBR322. Дана плазміда має багато властивостей ідеального вектора для клонування. Оскільки pBR322 реплицируется по типу Col Е1 (Col Е1-це плазмида, яка здатна накопичувати кілька тисяч копій плазмідної генома, навіть коли клітина не росте і не ділиться), вдається отримати плазмидную ДНК з високим виходом. Плазміда містить два селективних гена-маркера, що додають стійкість до тетрацикліну і ампіциліну. Кожен з 12 сайтів впізнавання рестріктазамі зустрічається в молекулі тільки один раз, що дозволяє отримувати лінійні молекули з різноманітними «липкими» кінцями. Відома повна нуклеотидних послідовність цього вектора довжиною 4362 пари нуклеотидів.
Клітини E. coli. містять плазміду pBR322, вирощують в середовищі з ампіциліном або тетрацикліном або в присутності обох антибіотиків, при цьому клітини, що втратили плазміду, не ростуть в присутності будь-якого з двох антибіотиків. Якщо який-небудь фрагмент ДНК впроваджений в область pBR322, відповідальну за стійкість до тетрацикліну (наприклад, в сайт рестрикції Bam HI або Sal I), то такі трансформанти зберігають здатність рости на середовищі з ампіциліном, але не ростуть на середовищі з тетрацикліном. Якщо ж вставка відбувається по ампіциліновий гену (по сайтам рестрикції Pvu I або Pst I), то спостерігається зворотна ситуація. При будь-якої локалізації вставки легко здійснити відбір тільки тих колоній бактеріальних клітин, які несуть рекомбинантную плазмидную ДНК.
Молекула ДНК фага l, що складається з 48502 пар нуклеотидів, включає область почала реплікації, а також гени, що кодують структурні вірусні білки і ферменти необхідні для реплікації ДНК, лізису інфікованих клітин і встановлення лизогении. Приблизно 30% генома представлено областю, необов'язковою для литической інфекції. Як правило багато або навіть усі гени, потрібні для лизогении, видаляються, тому інфікування E. coli рекомбінантним вектором завжди супроводжується лізисом клітини-господаря.
Фаг М13 входить в групу ниткоподібних бактеріофагів E.coli. Геном фага представлений одноцепочечной кільцевої ДНК, котор. упакована в капсид. Фаг M13 здатний інфікувати клітини T.coli тільки якщо вони мають F-пілямі.
До таких гібридним векторах відносяться косміди і фазміди.
Косміди - один з типів гібридних векторів, які характеризуються плазмідних типом реплікації і мають здатність упаковуватися в умовах in vitro в головки фага l. Типова косміди містить область почала реплікації, включає унікальні сайти рестрикції і селективні маркери, що належать плазмідної ДНК, яка об'єднана з фрагментом ДНК фага l, що містить фагів «липкі» кінці (cos -cайти). Реціпіентние клітини-господарі набувають упаковані в віріони косміди в результаті інфікування «фальшивими» фагів частинками. Потрапивши в клітку, рекомбінантна ДНК амплифицируют і зберігається в ній у вигляді плазміди.
Косміди по суті є плазмідними векторами, що мають лише cos -cайт фага l, необхідний для здійснення ефективної упаковки рекомбінантної ДНК in vitro.
Щирими гібридами плазміди і фага є фазміди - лінійні дуплексні молекули ДНК, на кінцях яких розташовані сегменти ДНК фага l, що містять всі гени, що вимагаються для литической інфекції, а середня частина представлена линеаризованной плазмидой. Функції реплікації як фага, так і плазміди в фазмідах повністю збережені. Зазвичай такі вектори містять кілька повторів плазмидной частини, що забезпечують необхідну для упаковки ДНК протяжність генома. Один або кілька плазмідних повторів при конструюванні рекомбінантних ДНК замінюють відповідною вставкою.
Фазмідние ДНК перед інфікуванням упаковують in vitro в фагів головки. Потрапляючи в клітину E. coli. фазміда реплицируется як фагів ДНК, в результаті чого на газоні чутливих клітин утворюються бляшки. Однак якщо вектор містить ген, що кодує репрессор фага l, то фазміда реплицируется як плазміда, а не як фаг.