Рестріктази типу II - основний інструмент генної інженерії. Більшість рестриктаз типу II специфічно впізнають на ДНК тетра-і гексануклеотідние послідовності, а принаймні три з них - октануклеотіди. Чим коротше олігонуклеотидних послідовність сайту рестрикції, впізнаваного рестриктазой, тим частіше він зустрічається у випадковій послідовності нуклеотидів, в якій кожен з чотирьох нуклеотидів представлений з однаковою частотою (50% А-Т-пар і 50% G-С-пар). Так, випадкова тетрануклеотідная послідовність зустрічається в середньому через кожні 256 п.о. а гексануклеотідная - через кожні 4096 п.о. Однак в природних ДНК розподіл нуклеотидів може помітно відрізнятися від випадкового. Наприклад, для еукаріотичних ДНК характерна низька частота народження динуклеотид CpG і відповідно сайтів рестрикції, що містять ці дінуклеотід (рестріктази HhaI. HpaII. TaqI. ThaI. AvaI. HaeII. HindII. SalI. SmaI. XhoI. XmaI). Для хромосомами термофільних бактерій, навпаки, властиво (хоча і не у всіх випадках) збагачення по G-С-парам.
Для більшості сайтів, відомих рестріктазамі типу II, характерна наявність в них симетрії другого порядку, тобто впізнавані ними послідовності є паліндроми, наприклад, у рестріктази EcoRI - 5'-GAATTC-3 '. Це означає, що нуклеотиди, розташовані в кожній з ланцюгів на рівній відстані від осі симетрії, комплементарні один одному. Якщо точки розщеплення протилежних ланцюгів ДНК зміщені один щодо одного в сайті рестрикції, то утворюються в результаті рестрикції кінці ДНК містять виступаючі одноцепочечниє ділянки. Оскільки такі ділянки комплементарні самі собі і один одному і можуть між собою взаємодіяти, їх часто називають "липкими" кінцями. В "липких" кінцях виступаючим одноланцюговим ділянкою може бути як 5'-, так і 3'-кінець (рис. II.1, а). Формальною ознакою освіти 5'- або 3'-виступаючих "липких" кінців в сайтах рестрикції є розташування точки розщеплення ланцюгів ДНК в послідовності, що використовується для позначення сайту рестрикції, ліворуч або праворуч від осі симетрії відповідно. У деяких рестриктаз точки розщеплення обох ланцюгів ДНК розташовані безпосередньо один під одним в сайті рестрикції. У цьому випадку після розщеплення ДНК "липких" кінців не утворюється, а виходять так звані "тупі" кінці, в яких немає виступаючих одноланцюгових ділянок ДНК (рис. II.1, а). Є функціональне розходження між 5'і 3'-виступаючими "липкими" кінцями - останні неможливо помітити шляхом їх добудови ДНК полімеразою, що необхідно враховувати при виборі рестриктаз для отримання рестрикційних фрагментів ДНК.
Хоча рестріктази BamHI. BclI. BglII і XhoII дізнаються різні сайти рестрикції, вони утворюють одні і ті ж "липкі" кінці, GATC. Те ж характерно і для групи рестриктаз SalGI. XhoI і AvaI (NCGA). При лигирование фрагментів ДНК, утворених рестріктазамі однієї з таких груп, відбувається їх об'єднання, але при цьому вихідні сайти рестрикції губляться, так як в результаті утворюється нова безперервна послідовність нуклеотидів (рис. II.1, б).
Сайти рестрикції для деяких рестриктаз II типу не є симетричними. Наприклад, рестриктаза HhaI дізнається асиметричну послідовність 5'-GACGC-3 ', а одноцепочечниє розриви вносить в протилежні ланцюга ДНК, відступивши вправо на 5 і 10 нуклеотидів відповідно. Послідовності нуклеотидів утворюються "липких" кінців є унікальними для кожного такого сайту рестрикції. Внаслідок цього рестрикційні фрагменти ДНК, що утворилися під дією даної рестріктази, в суміші з'єднуються один з одним в строго визначеної вихідної послідовності, яка задається унікальними послідовностями нуклеотидів в "липких" кінцях рестрикційних фрагментів ДНК. Наприклад, при розщепленні цієї рестриктазой репликативной форми ДНК фага фX174 утворюється 14 фрагментів, які in vitro об'єднуються в правильну послідовність з утворенням інфекційної фX174-ДНК.
Випадковий малюнок з бази знань:
Увага! Інформація на сайті
www.humbio.ru призначена виключно для освітніх
і наукових цілей