Переходячи до розгляду варіантів істинної хроматографії, корисно ввести поняття «рухомий» і «нерухомою» фаз. Мається на увазі рух фракціоніруемих молекул вниз по колонці. Рухливу фазу, природно, становлять молекули, що знаходяться поза гранул. Вони рухаються разом з струмом елюента. Нерухому фазу - молекули, що знаходяться всередині гранул. Такий поділ мало місце і при гель-фільтрації. Там нерухомі в зазначеному сенсі молекули були такими в силу їх розчинення в нерухомій водному середовищі, заповнювала гранули. Звичайно, і в цьому середовищі вони здійснювали броунівський рух, але це не посувало їх до виходу з колонки. З матеріалом самих гранул вони якщо і взаємодіяли, то чисто механічно - наштовхуючись на нитки полімеру, що утворює гранули.
У разі іонообмінної хроматографії, навпаки, нерухому фазу, в основному, складають молекули певним чином пов'язані з матеріалом гранул ( «сорбованих» на ньому). Пористість останніх в цьому випадку вибирають так, щоб фракціоніруемие молекули могли б практично безперешкодно проникати в гранули, заповнюючи весь їх внутрішній об'єм.
Сама назва ионообменная хроматографія вказує на те, що зв'язок молекул з гранулами повинна бути іонна. Тобто визначатися кулоновскими силами тяжіння між іонами протилежних знаків, закріпленими на нитках гранул і існуючими на поверхні молекул. Слова «закріплені» і «існуючі» наводять на думку про раз і назавжди фіксованою ситуації. Тим часом, гнучкість і ефективність методу іонообмінної хроматографії спирається саме на можливість керування цією ситуацією, а разом з нею і силою зв'язку молекул фракціоніруемого речовини з матрицею гранул - характером сорбції цих молекул.
Замість незмінних іонів на нитках матриці і на поверхнях макромолекул (наприклад білків) розташовуються «йоногенних групи», які в залежності від умов в навколишньому їх водному середовищі (рН, наявність солей) можуть проявляти себе або як відкриті, несуть електричний заряд іони, або бути нейтралізованими за рахунок зближення з ними несучих протилежний заряд іонів, наприклад Na + або С1, а іноді за рахунок дисоціації або приєднання протонів Н +.
На поверхні білків йоногенних групами закінчуються бічні гілки таких амінокислот, як лізин і аргінін або аспарагінова і глутамінова кислоти. Дисоціація протона в першому випадку і асоціація в другому нейтралізують ці групи. Обидва ці процесу залежать від концентрації протонів в навколишньому водному середовищі, т. Е. Від величини рН (відповідно в лужному або кислому області). Замість хімічної модифікації, якою є обидва названі явища, нейтралізація заряду ионогенной групи може відбуватися і за рахунок його екранізації протилежно зарядженим іоном, відповідним під дією кулонівської сили впритул до ионогенной групі з навколишнього середовища. Ковалентного хімічного зв'язку не утворюється. Екранує іон в цьому випадку іменується «контріоном».
Йоногенних групи, здатні виявляти свій позитивний заряд, іменуються «аніонітами» - вони в якійсь мірі подібні анода в електричному ланцюзі. Групи, що відкривають свій негативний заряд, відповідно іменуються «катионитами». Для модифікації ниток хроматографических гранул практика відібрала невелике число йоногенних груп різної «сили». Найбільш вживаними для «аніонообменнікі» (хроматографических матриць, несучих аніоніти) є: діетіламі-ноето - скорочена назва ДЕАЕ і ді-етил-2-оксіпропіламіноетіл скорочена назва QAE. Зауважимо, що перша з цих груп порівняно легко може нейтралізуватися хімічно в лужному середовищі за рахунок втрати протона. Друга - несе позитивний заряд при будь-якому значенні рН середовища і може нейтралізуватися тільки екранізацією негативнозарядженим контріоном. Відповідно до цією відзнакою аніонообменнікі на основі ДЕАЕ іменуються «слабкими», а обмінники на основі QAE - «сильними».
Аналогічно і в випадку негативних йоногенних груп, «катіонообмінники» бувають «слабкими» - вони несуть карбоксіметільние групи і «сильними», які модифіковані сульфопропільнимі групами. Скорочені позначення цих груп, відповідно, СМ і SP. Сильні катіонообмінники зберігають свій негативний заряд у всьому робочому біологічному діапазоні значень (Рнз - 11) і можуть бути тільки заекраніровани позитивними контріонамі.
Що ж стосується матриць, несучих описані модифікації (в разі фракціонування біополімерів), то це вже знайомі нам гранули на основі полісахаридів: сефадексе, хімічно зшиті агарози і целюлози. В їхніх торговельних найменуваннях присутні і назва матеріалу матриці і скороченого вказівки ионогенной групи. Наприклад: «ДЕАЕ-сефадексе», «QAE-целюлоза», «СМ-сефадексе», «SP-сефароза CL» і т. Д. У кожному типі пропонується кілька обмінників, що розрізняються між собою розмірами гранул і пір.
Матриці для іонообмінної хроматографії при високому тиску (на основі силікагелю) я залишаю осторонь. Фірма Pharmacia для своєї системи швидкої хроматографії білків розробила на основі виключно однорідних за розмірами гранул два типи сильних ионообменников: аніонообменнік під торговою назвою «Моно Ф» - активна група тріметіламінометіл і катіонообменік «Моно S» - активна група сульфометіл.
Тепер корисно буде уявити собі деякі просторові співвідношення. Будемо орієнтуватися на очистку та фракціонування білків, оскільки це - основна область використання іонообмінної хроматографії. Діаметри глобулярних білків (на відміну від їх мас) варіюють не надто сильно. Так наприклад, молекула бичачого сироваткового альбуміну (М = 69 000) має в поперечнику 70 А, а молекула гамма-глобуліну (М = 150 000) близько 100 А. (Зважаючи на ці цифр я не згадував матриці на основі полістиролу, оскільки у них розмір пір лежить в межах 5-20 А.)
Пористість матриць, використовуваних для фракціонування білків, лежить в діапазоні 300-1000 А. В таких порах молекули білків можуть переміщатися так само вільно, як тенісний м'ячик в виготовленої з дроту просторової сітці з ребром осередки в 30-40 см.
На поверхні білків можуть перебувати йоногенних групи амінокислот обох знаків (всі - слабкі), віддалені один від одного на відстані в кілька десятків ангстремів. Йоногенних групи всередині гранул могли б розташовуватися тісніше, оскільки приєднання по ОН-груп могло б здійснюватися в кожній ланці глюкози. Але це марно, так як з двома настільки близько розташованими групами не змогли б в силу своїх розмірів взаємодіяти одночасно дві молекули білка, і невигідно, оскільки може призвести до занадто міцним зв'язуванням однієї молекули в декількох точках. Практика виробила для середньої відстані між йоногенних групами на одній матриці величину в 10-30 А.