Питання, що задається природі. Принципи експериментального дослідження.
"Експеримент - це питання, що задається природі." Сьогодні мені хотілося б поговорити про мову, на якому це питання задається, і на якому виходить відповідь на нього.
Схема "вплив - ефект"
Отже, розробляючи цікаву для нас проблему, ми прийняли деяку робочу гіпотезу і тепер мають намір перевірити її експериментально. Як же ми повинні побудувати експеримент?
Не завжди, але дуже часто метою експерименту є встановлення деякої причинно-наслідкового взаємозв'язку. Наприклад, ми можемо цікавитися, чи є деяка реакція органу результатом впливу на нього деякого гормону. Для того щоб відповісти на таке питання, існують два методи - можна зруйнувати існуючу в природі взаємозв'язок (скажімо, видалити залозу, яка продукує цікавий для нас гормон, і подивитися, чи збережеться реакція органу), а можна, навпаки, змоделювати дію досліджуваного фактора (в нашому прикладі - ввести гормон в кров і подивитися, яка буде відповідь). Ми бачимо, втім, що в обох випадках схема експерименту виявляється подібною - ми видаємо деякий експериментальне вплив і спостерігаємо його ефект. У першому випадку впливом було видалення залози, у другому - введення екзогенного гормону. Схема "вплив - ефект" застосовується майже універсально; перше завдання дослідника зазвичай полягає в тому, щоб вибрати відповідне для його цілей вплив, друга - щоб придумати адекватний спосіб реєстрації ефекту.
Вимоги до експериментального впливу.
На цьому, не такі вже й складному, прикладі ми бачимо, що вимога до впливу -визначення чином впливати на досліджуваний параметр, але не впливати суттєво на інші умови експерименту - має дуже просте формулювання, але дотримання цієї вимоги пов'язане зі значними труднощами і вимагає дійсно глибоких знань досліджуваного предмета і ретельного продумування.
З вимоги елементарності впливу безпосередньо випливає ще одна вимога - вплив має бути якомога більш повно охарактеризовано, тобто, ми повинні якомога краще знати, що саме цей вплив робить з досліджуваним об'єктом. Так наприклад, нас знову цікавить участь якогось гормону в регуляції якогось параметра. Один з можливих способів дослідження - ввести в організм антагоніст рецепторів до гормону, так що він не зможе впливати на орган-мішень. Це стандартний, широко застосовуваний експериментальний прийом, але разом з тим, прийом, пов'язаний з серйозними труднощами інтерпретації. Тут завжди виникають два питання. По-перше, чи достатньо специфічно вплив? Чи немає у використаного речовини якихось неврахованих фізіологічних ефектів? Чи не діє воно ще на якісь, можливо, невідомі рецептори? І по-друге, чи достатня використана концентрація? Чи досягається досить повне придушення природного ефекту гормону? Таким чином, застосування фармакологічного агента на цілісному організмі - це майже завжди недостатньо повно охарактеризовані вплив, наслідком чого є сумнів в його елементарності; подібних ситуацій слід, наскільки це можливо, уникати, знаходячи більш повно вивчені впливу.
Вимоги до реєструючої та вимірювальної апаратури
Далі, слід мати на увазі, що ніяке вимір не є абсолютно точним. Характеристикою точності вимірювання є його похибка - тобто різницю між істинним і виміряним значеннями величини. Похибки поділяються на систематичні і випадкові. Систематична похибка - однаковий за величиною і знаку відхилення вимірюваної величини від істинного значення - найчастіше буває пов'язана з несправністю приладу (наприклад, неправильної градуировкой шкали) або особливостями методу. Наприклад, якщо вимірюють концентрацію якоїсь речовини недостатньо специфічним методом, який чутливий не тільки до цікавого речовини, але і до постійно присутнім домішкам, то будуть виходити систематично завищені значення. Систематичні помилки досить часто можуть бути усунені, їх зазвичай досить легко врахувати, а в дослідженнях, де порівнюються різні виміри, виконані одним і тим же приладом, вони взагалі не позначаються на результаті. Випадкові похибки пов'язані з різноманітними різноспрямованими процесами, які в різних вимірах відхиляють виміряне значення від істинного в різних напрямках і на різну величину. Повністю виключити випадкові похибки неможливо, а оцінити можна тільки в середньому, провівши кілька повторних вимірів однієї і тієї ж величини. Отже, перше, досить очевидне, вимога до вимірювальної апаратури полягає в тому, що її похибка повинна бути істотно - хоча б на порядок - менше, ніж величина очікуваного дослідником ефекту. Якщо це взагалі можна досягти на сучасному рівні розвитку експериментальної техніки, зрозуміло. У той же час, не слід прагнути завжди використовувати гранично точні вимірювальні прилади, оскільки дуже точні прилади зазвичай ще й дуже дорогі, а розкид вимірюваних величин може бути викликаний не тільки приладової похибкою.
Крім того, від вимірювальної апаратури зазвичай вимагають, щоб вона створювала об'єктивно документовану запис досліджуваного процесу. так, щоб цей запис згодом міг проаналізувати сам експериментатор, або інший дослідник, що зацікавився отриманими результатами. Наведений на рис.1. графік м'язового скорочення - хороший приклад такого запису.
Далі, очевидно, що прилад може зареєструвати тільки така подія, яка якось впливає на цей прилад. Але односторонніх дій в природі не буває - йдеться завжди про взаємо дії приладу і досліджуваного об'єкта - отже, прилад в процесі вимірювання впливає на поведінку досліджуваного об'єкта. Як приклад, розглянемо рис.1. На ньому представлений графік м'язового скорочення, викликаного одиночним нервовим імпульсом. Відразу після імпульсу м'яз коротшає (висхідний ділянку кривої), потім розслабляється (спадний ділянку). Однак, в даний момент для нас найбільш цікавий фрагмент, обведений кружком. Видно, що м'яз подовжується значно сильніше, ніж в базальних умовах, знову коротшає і тільки після цього набуває звичайну довжину. Чому це відбувається? Щоб відповісти на це питання, розглянемо уважніше реєструючий пристрій. Його схема приведена на рис. 2. При скороченні м'яза 1 пише кінець важеля 5 піднімається і фіксує скорочення на барабані, що обертається 4. Коли м'яз розслабляється, важіль падає під дією сили тяжіння. При цьому він встигає набрати досить велику швидкість, так що в кінці руху пружно розтягує м'яз, яка потім коротшає, і отримані затухаючі коливання реєструються приладом. Таким чином, спостерігається подовження м'яза понад базального рівня в кінці фази розслаблення не є її власним властивістю, але викликається впливом на неї з боку експериментальної установки. Такі псевдоеффекти, що виникають в результаті дії експериментальної процедури на об'єкт і спотворюють його поведінку, прийнято називати артефактами. У деяких випадках - як в тільки що розглянутому - штучне походження артефакту легко виявити, так що він виявляється досить нешкідливим. У більш складних випадках, однак, буває не так-то легко відрізнити артефакт від відкриття. І тут знову-таки необхідно глибоке знання всіх протікають в експериментальній системі процесів - фізичних, хімічних і біологічних.
Отже, ми з'ясували, що експериментальна процедура сама по собі може впливати на поведінку об'єкта, так що виникає задача розрізнення досліджуваного ефекту експериментального впливу і побічних ефектів, пов'язаних з вимірюваннями. Як можна вирішити цю задачу?
План і умови експерименту
Перш за все, умови експерименту повинні бути максимально стандартизовані: хімічний експеримент повинен виконуватися при контрольованих і строго визначених pH, іонному складі розчину, температуру, тиск і т.д .; в фізіологічному експерименті тварини повинні отримувати стандартну їжу, мати стандартний світловий день, у віварії повинна підтримуватися певна температура, клітини повинні чиститися в певний час і т.д. Зауважимо, що стандартизувати слід по можливості всі умови, навіть якщо не ясно, чи можуть вони впливати на результат досвіду - дослідник адже ніколи не знає всіх властивостей досліджуваного об'єкта, а тому не може бути впевнений, що якийсь фактор не впливає на результат.
Отже, умови експерименту повинні бути гранично стандартними. Але абсолют недосяжний, і в дійсності всі умови будуть дещо відрізнятися від досвіду до досвіду, що буде вносити в результати додаткову похибка, так що загальна похибка експериментальних результатів буде складатися з двох компонентів - приладової похибки і похибки методики. Далі, що розкид даних залежить не тільки від похибки експерименту, але має і більш фундаментальне джерело - а саме, дисперсію властивостей експериментальних об'єктів. Так, фізіологічний експеримент ставиться на тварин - покладемо, на щурах. Але ніякі два пацюки, очевидно, не можуть бути цілком ідентичними. У них можуть бути генетичні відмінності, вони виросли в різних клітинах - і стало бути, в різних умовах. Тому, як кажуть старі фізіологи, - "ein досвід - kein досвід" (один досвід - не досвід). Для того, щоб кількісно оцінити величину похибки експерименту (або, використовуючи більш загальний вираз, величину розкиду даних), необхідно поставити серію дослідів. Результати кожного досвіду в цій серії будуть дещо відрізнятися один від одного, але, вивчивши характер розподілу, можна дізнатися найбільш ймовірний результат і кількісно описати величину розкиду даних. Таке дослідження виконується методами математичної статистики, про яку ми докладніше поговоримо в наступній лекції.
Крім того, для того, щоб виділити ефект досліджуваного впливу з коливань результатів, викликаних випадковими чинниками, ставлять не одну, а дві серії експериментів - досвід і контроль. Досвід - це серія, в якій на об'єкт видається досліджуване вплив; в контрольному експерименті умови нічим не відрізняються від досвіду, але досліджуваного впливу не видається. Підкреслимо спеціально - відсутність експериментального впливу - це єдина відмінність контрольної групи від досвідченої; всі інші умови повинні бути ідентичні. Наприклад, якщо в якості впливу у тварини видаляють деяку залозу внутрішньої секреції, щоб вимкнути її гормони, то в якості контролю використовують не интактное, а помилково оперувати тварина - тобто йому проводять всю хірургічну операцію, за винятком власне вилучення залози. Це необхідно, тому що хірургічна травма входить в той комплекс експериментальних умов, який може якось впливати на результат, і який повинен бути ідентичним у контрольній і дослідній групі. Ця вимога ідентичності настільки важливо, що отримало спеціальну назву - принцип інших рівних умов. Його дотримання призведе, зокрема, до того, що артефакти, створювані Вашої установкою, будуть однакові в дослідній і контрольній серіях і не вплинуть на Ваш висновок про ефект впливу.
У тому випадку, коли на результат можуть впливати фактори, мінливість яких експериментатор не може контролювати, слід подбати принаймні про те, щоб ця мінливість була подібною у дослідній і контрольній серіях. Класичний приклад: вивчається вплив якогось нового добрива на урожайність помідорів. Найпростіше рішення: посадити дві грядки помідорів, одну обробляти новим добривом, іншу - старими. Чи хороша це ідея? Чи не занадто - на різних грядках може виявитися різну якість грунту, або різна освітленість або різна вологість ... Повністю стандартизувати умови в польовому експерименті навряд чи можливо. Одне з рішень проблеми полягає в тому, щоб вибрати кущі для обробки новим добривом на обох грядках у випадковому порядку, то можна розраховувати, що мінливість всіх цих неврахованих факторів буде приблизно однаковою у дослідній і контрольній групах. Такий прийом - випадкового розподілу дослідної та контрольної груп по неконтрольованим умов, отримав спеціальну назву рандомізації.
Отже, Ви поставили експеримент, виконали всі проміжні обчислення, і маєте перед собою дві колонки цифр - результати вимірювань в дослідній і контрольній серіях. Тепер необхідно перетворити Ваші дані в науковий результат - інтерпретувати їх. Перше питання, на який Ви повинні відповісти - чи відрізняються дані в досвіді і контролі. Це не такий тривіальний питання, як здається - адже величини як в досвіді, так і в контролі мають розкид, незалежний від Вашого впливу; діапазони досвіду і контролю можуть значною мірою перекриватися, так що відмінність в середніх величинах двох груп може бути просто проявом випадкової мінливості, але може бути і результатом впливу. Так ось, не існує способу з абсолютною надійністю сказати, чи дійсно два випадкових набору даних відрізняються один від одного. Однак, методи математичної статистики дозволяють оцінити достовірність відмінностей - тобто обчислити вірогідність того, що відмінності невипадкові. Далі, якийсь певний рівень достовірності приймають за граничний, після якого можна прийняти або відкинути гіпотезу про невипадковість відмінності. У біології існує традиція приймати цю гіпотезу якщо її ймовірність виявляється більше 95%.
Далі, припустимо, Ви зробили висновок - відмінності не випадкові. Тепер Вам необхідно пояснити цю різницю. Яким чином, за яким механізмом, Ваше експериментальне вплив призвело до отриманих результатів? Тут Вам доведеться залучити всі свої знання про досліджуваному об'єкті і експериментальної методики, глибоко продумати, які зміни в об'єкті могло викликати Ваше вплив і за якими взаємозв'язкам воно могло змінювати поведінку об'єкта. Це найскладніший етап в інтерпретації даних, з яким пов'язано найбільше помилок - бо легко можна випустити з виду якусь істотну взаємозв'язок. З цього приводу існує - і у експериментаторів користується великою популярністю - наступна жарт: потрібно довести, що тарган чує ногами. Для цього беремо таргана, ставимо його на стіл і стукаємо по столу. Тарган починає бігти. Після цього обриваємо таргану ноги, знову поміщаємо його на стіл і стукаємо по столу. Тарган залишається нерухомим. Висновок - він не чув, як ми стукали. Отже, тарган чує ногами.
І останнє питання - наскільки отримані в досвіді дані відповідають тому, що відбувається в природі? Принаймні в біології, необхідно ясно віддавати собі звіт в тому, що об'єкт, поміщений в умови лабораторного експерименту, відрізняється від об'єкта в його природному оточенні. Отже, експериментальні дані - суть дані, отримані на експериментальній моделі, більш-менш відрізняється від об'єктів, які можна зустріти в природних умовах. Наскільки важливі ці відмінності? - питання, яке повинен ставити собі всякий експериментатор-біолог.
Отже, в цій лекції ми обговорили деякі принципи експериментального мистецтва. Ми з'ясували, що експеримент, як правило, ставиться за схемою "вплив - ефект", при цьому ми повинні прагнути до елементарності впливу - так, щоб воно, по можливості, впливало єдино на досліджуване нами властивість об'єкта дослідження; необхідною умовою елементарності є досить повна вивченість цього впливу. Далі, ми з'ясували, що реєстрований ефект повинен бути однозначно інтерпретуємо - так що ми повинні дійсно знати, що саме ми вимірюємо; бажано, щоб результати вимірювання були об'єктивно задокументовані - що дозволяє, зокрема, звести до мінімуму суб'єктивізм в інтерпретації даних. Ми з'ясували, крім того, що вимірювання неминуче мають деяку похибка, внаслідок чого виявляється необхідним ставити не поодинокі експерименти, але серії експериментів. Похибка при цьому може бути кількісно оцінена методами математичної статистики. Далі, для того, щоб відрізнити ефект впливу від випадкового розкиду даних, необхідно ставити дві серії експериментів - досвід і контроль, які розрізняються виключно присутністю або відсутністю експериментального впливу і є ідентичними в іншому - принцип інших рівних умов. Ми з'ясували, що експериментальна процедура може змінювати поведінку об'єкта, породжуючи хибні ефекти - артефакти; так що інтерпретація отриманих результатів вимагає глибокого продумування з тим, щоб не прийняти артефакт від відкриття. (До речі, зворотні помилки іноді теж трапляються, хоча і значно рідше). Дотримання всіх цих принципів дозволяє мінімізувати можливість експериментальних помилок - але, на жаль, не може виключити її зовсім. Так що ще один - раніше в цій лекції не згадується - принцип полягає в тому, що до своїх (та й чужим) експериментальними даними слід завжди ставитися критично; одного експериментального факту ніколи не буває достатньо, щоб вирішити долю теорії - як ми і говорили в наших перших лекціях. Між іншим, ця обставина відображена і в мові науки - в ній майже ніколи не використовується слово "доведено", але майже завжди говорять - підтверджено; іноді - добре підтверджено. Абсолютну істину в експерименті не отримують.