Діагностичне значення дослідження активності ізоферментів КФК
Методи визначення активності КФК
Стандартні клініко-лабораторні показники
Роль креатинфосфокінази в метаболізмі м'язової тканини
Кінетика дії КФК
Перенесення енергії з мітохондрій в цитоплазму клітини міокарда за допомогою ізоферментів КФК
Активність КФК в мембранах саркоплазматичного ретикулума міокарда в умовах експериментальної коронарної недостатності
Вплив алкогольної інтоксикації і процесів старіння на активність креатинфосфокінази і її ферментів
Історія вивчення креатинфосфокінази (КФК) цікава і незвичайна: не дивлячись на те, що вона почалася більше 80 років тому (з відкриття креатинфосфату в 1927 р), а креатінкіназная реакція була відкрита Ламаному і Леманн в 1934- 1936 роках, дослідники все ще відкривають нові функції креатінкіназной системи і проблема залишається далекою від вирішення. Розвиток ідей про фізіологічну роль креатінкіназной системи з самого початку було тісно пов'язане з успіхами в галузі вивчення м'язової фізіології та біоенергетики. Зі свого боку, дослідження креатінкіназной системи вносять помітний внесок у формування уявлень про загальні принципи організації метаболізму і метаболічного контролю в клітці.
Мета роботи: дослідження сучасних поглядів на будову і біологічну роль креатинфосфокінази.
Креатинкіназа (КФ 2. 7. 3. 2) - відноситься до фосфотрансферази з азотовмісними групою в якості акцептора.
До класу трансфераз відносять ферменти, що каталізують різні перетворення, що представляють собою перенесення радикала від молекули-донора до молекули-акцептора і не є процесом гідролізу. Найменування їх складається за формою: «донор - транспортується група - трансфераза».
У 1964 р було відкрито ізоферменти креатинфосфокінази: цитоплазматические ВВ-КФК (від англ. Brain - мозок), ММ-КФК (від англ. Muscle - м'яз) і гібридна форма - МВ-КФК, а також мітохондріальний ізофермент - мт-КФК.
У серці цитоплазма містить половину ММ-форми, а також всю МВ- і ВВ-КФК; їх сумарна активність складає 40-50% від загальної активності.
Діагностичне значення дослідження активності ізоферментів КФК
Дослідження активності ізоферментів КФК в сироватці крові має важливе діагностичне значення. Ферменти креатинкінази особливо важливо досліджувати при гострому інфаркті міокарда, так як МВ-форма в значній кількості міститься майже виключно в серцевому м'язі. Підвищення активності МВ-форми в сироватці крові свідчить про поразку саме серцевого м'яза.
Методи визначення активності КФК
Уніфікованим методом визначення активності креатинфосфокінази служить метод з використанням в якості субстрату реакції креатину. Активність ферменту пропорційна кількості неорганічного фосфору, що утворюється в результаті кислотного гідролізу продукту креатінкіназной реакції - креатинфосфату. Неорганічний фосфор визначається по кольоровій реакції з молибдатом амонію. У нормі активність креатинкінази в крові, встановлена за допомогою цього методу, досягає 100 нмоль / (с * л), або до 6 МО. Активність МВ-форми креатинкінази становить менше 2% від загальної активності ферменту. Другим методом визначення активності креатинкінази, також прийнятим в якості уніфікованого, є метод з використанням в якості субстрату креатинфосфату. Активність ферменту пропорційна кількості креатину, що утворюється в результаті ферментативної реакції. Креатин визначається по кольоровій реакції з a-нафтолом. У нормі активність креатинкінази в сироватці крові, встановлена за допомогою цього методу, становить від 0 до 220 нмоль / (с * л), або від 0 до 13 МО [Міжнародна одиниця = 16,67 нмоль / (с * л)]. (Ленинджер А. Біохімія, М. 1976, с. 382).
Стандартні клініко-лабораторні показники
Креатинфосфокиназа (КФК) у сироватці
Норма: 10-50 МО / л при 30С0 (варіює залежно від методу визначення).
А. Застереження щодо проведення експерименту: фермент нестабільний, вміст еритроцитів пригнічує активність ферменту. Сироватка повинна бути швидко відділена від згустку. Якщо дослідження не може бути виконано негайно, сироватку слід заморозити.
Б. Фізіологічна основа: КФК розщеплює креатинфосфат (за участю АДФ) з утворенням креатину і АТФ. КФК багато в скелетної та серцевої м'язах, в мозку.
В. Інтерпретація отриманих даних:
Підвищення показника має місце при м'язових порушеннях (інфаркт міокарда, травма м'яза), при м'язової дистрофії, поліміозиті, сильному м'язовому напрузі (бігу), гіпотиреозі, інсульті. Після інфаркту міокарда КФК підвищується швидко (за 3-5 годин) і збережуться підвищеної 2-3 дня.
Показник не підвищується при інфаркті легкого або ураженні паренхіми печінки.
Ферменти креатинфосфокінази в сироватці (таблиця №1)
А. Застереження щодо проведення експерименту: такі ж, як і в випадку дослідження КФК (див. Вище).
Б. Фізіологічна основа: КФК представлена трьома ізоферментами, що розділяються при електрофорезі. Для скелетного м'яза характерний изофермент ММ, для міокарда МВ, для мозку - ВВ.
Таблиця №1. Ферменти креатинфосфокінази
Нормальний рівень (% від загального)
Зрушення, виявлені з боку активності КФК, тісно пов'язані зі структурними змінами в мембранах СПР, перш за все їх ліпідного складу. Так, в умовах коронарної недостатності спостерігається деяке зниження вмісту мембранозв'язаних холестерину, а також різке падіння рівня фосфоліпідів (на 40%),
При введенні антиоксидантного препарату AV-156Na спостерігалося односпрямоване зміна досліджуваних показників в бік їх нормалізації. Цей ефект свідчить про те, що рівень протікання перекисних реакцій в міокарді багато в чому визначає характер зміни окремих метаболічних процесів в мембранах.
Виявлене зниження активності КФК мембран СПР в умовах експериментальної ішемії може свідчити про певний порушенні нормального постачання енергією транспортної Са-АТФ-ази мембран СПР. При цьому зміна активності КФК відбувається на тлі значного зниження в мембранах СПР серця кроликів рівня фосфоліпідів. Можливо, ізофермент КФК. Пов'язаний з мембраною СПР, є ліпідзавісімим ферментом і для прояву повної його активності збереження нормальної ліпідної структури мембран - важлива і необхідна умова. (Фролькіс Р. А. Воронков Г. С. Дубур Г. Я. Ціомік В. А. Гомон І. В. - Деякі аспекти вивчення активності креатинфосфокінази в мембранах саркоплазматичного ретикулума міокарда в умовах експериментальної коронарної недостатності // Бюлетень експериментальної біології і медицини, М. 1983, №5, с. 53, 54).
Вплив алкогольної інтоксикації і процесів старіння на активність креатинфосфокінази і її ізоферментів
У відділі фармакології Інституту експериментальної медицини АМН СРСР (Ленінград) проводили досліди з виявлення вікових змін активності КФК в сироватці крові інтактних тварин у віці 4 і 24 місяців, а також вивчали вплив гострої алкогольної інтоксикації на активність КФК і її ізоферментів в тканинах і біологічних рідинах щурів 2 груп: 1) тварини у віці 4 місяців, яким за 3 години до початку експерименту внутрибрюшинно вводили 25% розчин етанолу в дозі 3 і 5 г / кг; 2) контроль - щури, яким вводили відповідні обсяги фізіологічного розчину. Перед декапітаціі у цих тварин під легким ефірним наркозом брали ліквор. В екстракті головного мозку, отриманому з кори великих півкуль, лікворі та сироватці крові визначали активність КФК і її ізоферментний профіль. Загальну активність ферменту визначали колориметричним методом. Ферменти поділяли за допомогою хроматографії на колонці на сефадексе ДЕАЕ А50. Кількість білка визначали мікробіуретовим методом. Статичну обробку проводили за Стьюдентом.
Аналізуючи дані про загальну активності КФК в сироватці крові щурів з гострою алкогольною інтоксикацією, а також у інтактних щурів різного віку, можна зробити висновок про те, що інтактні тварини у віці 4-5 місяців по активності КФК і її ізоферментних спектру різко відрізняються від інтактних щурів у віці 24 місяців (таблиця №3).
Таблиця №3.Общая активність КФК в сироватці крові щурів різного віку і щурів з гострою алкогольною інтоксикацією
Активність КФК в сироватці крові, МО / л
Інтактні щури у віці 4 міс. (N = 12)
У дозі 5 г / кг (n = 12)
Спостережуваний факт вікового зниження загальної активності КФК в крові, можливо, є наслідком зміни рівня загального метаболізму, уповільнення процесів оновлення тканин, зменшення рухової активності і т. Д.
При введенні етанолу в дозі 3 г / кг, загальна активність в крові різко збільшується за рахунок зростання активності всіх трьох форм ферменту. Поряд з цим спостерігається різка зміна процентного вмісту ізоферментів (рис. 1).
Ізоферментний спектр КФК в сироватці крові щурів різного віку і щурів з гострою алкогольною інтоксикацією
Ці дані свідчать про те, що етанол викликає структурні пошкодження мембран клітин на рівні всього організму, мозок і міокард страждають при цьому найбільше, так як абсолютний приріст активності для МВ- і ВВ-ізоферментів найбільший. (В 4 і 10 разів відповідно), в той час як активність ММ-КФК збільшується всього в 1,4 рази. Можна припустити, що джерелом сироваткової активності ВВ-КФК є тканину мозку. Для перевірки цього припущення була вивчена динаміка активності КФК в системі мозок - ліквор - кров (таблиця №4).
Таблиця №4. Активність КФК в головному мозку, лікворі та сироватці крові щурів при гострої алкогольної інтоксикації (n = 12)
Мозок, МО на 1 мг білка
Креатинфосфокиназа - ключовий фермент біосинтезу макроергічних субстрату - креатинфосфату, що грає разом з АТФ видатну роль в біоенергетиці серцевого м'яза і всього організму.
Визначення активності креатинкінази служить цінним діагностичним тестом при інфаркті міокарда та інших патологіях. На підставі послідовних вимірювань активності креатинкінази в сироватці крові можна судити про ступінь некротичного процесу в міокарді і оцінити ефективність проведеної терапії.
Але не всі аспекти функцій креатинфосфокінази вивчені. Важлива інформація може бути отримана при вивченні креатінкіназной системи в мозку, КФК цитоплазми і мітохондрій якого представлена іншими, ніж в м'язах, изоформами, а також в м'язових клітинах різних видів тварин, що стоять на різних щаблях еволюції; при різних патологічних станах.
2. Діксон М. Уебб Е. Ферменти, Т. 1, М. 1982.
4. Ленинджер А. Біохімія, М. 1 976.
7. Фролькіс Р. А. Воронков Г. С. Дубур Г. Я. Ціомік В. А. Гомон І. В. Деякі аспекти вивчення активності креатинфосфокінази в мембранах саркоплазматичного ретикулума міокарда в умовах експериментальної коронарної недостатності // Бюлетень експериментальної біології і медицини № 5, М. 1 983.
Ще роботи з біології
Реферат з біології