Тема: Лабораторна діагностика менінгококової і гонококових інфекцій.
Мета: На основі знань біології менінгококів, гонококів і особливостей їх взаємодії з макроорганизмом вміти обгрунтувати тактику мікробіологічної діагностики, профілактику і терапію що викликаються ними захворювань.
1. Особливості біології менінгококів і гонококів, що визначають їх роль в інфекційній патології людини.
2. Патогенез розвитку менінгококової і гонококових інфекцій.
3. Матеріал і методи мікробіологічної діагностики менінгококової і гонококових інфекцій.
4. Специфічну профілактику і терапію менінгококової, гонококових інфекцій.
1. Вміти микроскопировать препарати із спинномозкової рідини, уретрального гною і інтерпретувати отримані результати.
2. Поставити, врахувати і оцінити результати реакції латекс-аглютинації з менінгококової сироваткою та спинномозковій рідині.
3. Готувати фіксовані мазки з чистих культур, микроскопировать їх і інтерпретувати отримані результати.
4. Врахувати і оцінити результат вивчення біохімічних властивостей і визначення антибіотикограми досліджуваних культур.
5. Визначити видову належність досліджуваних культур.
1. Класифікація і морфобіологічні властивості менінгококів, гонококів.
2. Фактори вірулентності менінгококів і гонококів.
3. Екологія, особливості епідеміології, патогенезу менінгококової і гонококових інфекцій.
4. Матеріал і методи мікробіологічекой діагностики менінгококової, гонококових інфекцій.
5. Специфічна профілактика менінгококової інфекцій.
6. Специфічна терапія гонококових інфекцій.
Завдання, що виконуються в ході заняття (УИРС):
1. Провести дослідження СМЖ хворого з клінічним діагнозом «менінгіт»:
1.1. Промікроскопувати готовий препарат з осаду спинномозкової рідини, пофарбований метиленової синькою, оцінити отриманий результат.
1.2. Поставити, врахувати і оцінити результати реакції латекс-аглютинації зі СМЖ і менінгококової сироваткою.
1.3. На підставі отриманих результатів дати висновок.
2. Провести бактеріологічне дослідження носоглоткового виділень з метою встановлення менінгококового носійства:
2.1. Ознайомитися з тампоном, використовуваним для забору слизу з задньої стінки глотки (демонстрація).
2.2. Оцінити результати посіву слизу з задньої стінки глотки на сироватковий агар з ристоміцином.
2.3. Приготувати препарат з агарної культури, виділеної від обстежуваного, забарвити за Грамом, промікроскопувати.
2.4. Врахувати і оцінити результати посіву досліджуваної культури на звичайний живильний агар, 2 пробірки з сироватковим агаром (37 ° С, 22 ° С), «строкатий ряд».
2.5. Визначити антибіотикограму досліджуваної культури.
2.6. Отримані результати занести в протокол і зробити висновок; заповнити бланк-направлення та бланк-відповідь з бак. лабораторії.
3. мікроскопувати препарат з уретрального гною хворого з підозрою на гонорею. Дати висновок.
4. Врахувати і оцінити результати РСК з сироваткою хворого з підозрою на хронічну гонорею. Дати висновок.
5. Ознайомитися і описати в протоколі біопрепарати: хімічна менінгококова вакцина А + С, агглютинирующие менінгококової сироватки, діагностичні менінгококової сироватки для латекс-аглютинації, гонококковая вакцина, гоноаллерген, вказавши, що вони собою являють, для чого і як застосовуються.
6. Контрольна робота: патогенні коки.
Методичні вказівки до виконання дослідницького завдання:
I. Проведіть дослідження СМЖ хворого з клінічним діагнозом "менінгіт", для чого:
· Промікроскопіруйте готовий препарат з осаду спинномозкової рідини, пофарбований метиленової синькою, оцініть отриманий результат.
Одним із збудників гнійних менінгітів є менінгококи. Для їх виявлення використовують СМЖ, отриману шляхом люмбальної пункції. Бажано взяти матеріал відразу при надходженні хворого в стаціонар і до початку терапії.
Взяття СМЖ - лікарська маніпуляція, яка здійснюється з дотриманням правил асептики. Прозору СМЖ перед дослідженням центрифугируют при 3500 об / хв протягом 5 хв і готують мазки з осаду. З каламутній СМЖ мазки готують без центрифугування. Мазки фарбують метиленовим синім і Граму. Виявлення грамнегативних диплококков бобовидной форми, звернених увігнутою стороною один до одного і знаходяться в лейкоцитах, свідчить про менінгококової етіології менінгіту.
· Поставте, врахуйте і оціните результати латекс-аглютинації зі СМЖ і менінгококової сироваткою.
Менінгіт - це важке і швидко протікає захворювання. Тому важливо диагносцировать його в ранні терміни і швидко, щоб почати своєчасне етіотропне лікування. До числа таких методів, крім РИФ з люминесцирующей імунною сироваткою, відноситься латекс-аглютинація для виявлення специфічних полісахаридних антигенів N. meningitidis A, B, C, Y / W в спинномозковій рідині. При цьому потрібно мати на увазі, що мікроскопія СМЖ не завжди дозволяє виявити менінгококи.
Для постановки реакції латекс-аглютинації СМЖ підігрівають протягом 3 хв при 100 ° С і центрифугують протягом 5 хв. По краплі надосадової рідини і реагенту, що містить латексні частинки з моноклональними антитілами до менінгококів, нанесіть на ... і змішайте з допомогою спеціальної палички. Паралельно поставте реакцію зі свідомо позитивним контролем і реакцію з досліджуваної спинномозкової рідини і латексними частинками з IgG НЕ імунізовані кролика.
Облік результатів здійснюється через 10 хв по феномену аглютинації, мабуть неозброєним оком. Позитивна реакція - чітка аглютинація, в разі наявності аглютинації зі свідомо позитивним контролем і відсутність реакції аглютинації з латексом з IgG НЕ імунізовані кролика, свідчить про наявність специфічних антигенів N. meningitidis в спинномозковій рідині і вказує на його етіологічну роль у розвитку менінгіту. Реакція не тлумачиться, якщо аглютинація відбулася з латексом для негативного контролю. В цьому випадку потрібно повторити тест з іншого порцією спинномозковій рідині.
· Результати мікроскопічного дослідження і латекс-аглютинації занесіть в протокол і зробіть висновок; заповніть бланк-направлення та бланк-відповідь з бак. лабораторії.
II. Проведіть бактеріологічне дослідження носоглоткового виділень з метою встановлення менінгококового носійства.
1 етап. В носоглотці менингококки можуть бути виявлені не тільки у хворих, але і у носіїв. Матеріал для дослідження забирають натщесерце або не раніше, ніж через 3-4 години після їжі, до початку антимікробної хіміотерапії. Для цього використовують спеціальний носоглотковий тампон, який на ¾ довжини згинають під кутом 45 °. Тампон заводять за м'яке піднебіння і 2-3 рази проводять по задній стінці носоглотки, не торкаючись мови, зубів, слизової оболонки щік. Досліджуваний матеріал засівають відразу або доставляють в лабораторію, не пізніше 2-х ч, помістивши тампон в пробірку таким чином, щоб він не торкався стінок. Досліджуваний матеріал і посіви слід оберігати від охолодження і висушування, так як менінгокок дуже чутливий до впливу цих факторів. Тому для доставки використовують спеціальну термосумку з грілками.
Посів методом «штрих з майданчиком» здійснюється на чашки з поживним агаром, що містить кров, сироватку або асцитичної рідини. Паралельно використовують дане середовище з додаванням ристомицина, який затримує розмноження грампозитивнихкоків, що містяться у виділеннях носоглотки. Посіви інкубують при 37 ° С і підвищеної концентрації вуглекислоти (5-10%) протягом 24-48 год.
2 етап.Оценіте результати посіву слизу з задньої стінки глотки на сироватковий агар з ристоміцином.
Менінгококи утворюють невеликі, круглі, прозорі колонії, мають в світлі блакитний відтінок. Характерні ізольовані колонії пересівають на сироватковий агар для отримання чистої культури і термостатируют при 37 ° С 18-24 ч.
3 етап.Пріготовьте препарат з агарної культури, виділеної від обстежуваного, пофарбуйте по Граму, промікроскопіруйте.
Культуру ідентифікують за трьома тестами, що дозволяє віднести її до роду Neisseria. Це характерна морфологія (поліморфні дипло- і тетракоккі), грам забарвлення і позитивна реакція на оксидазу. Для визначення оксидази вивчену культуру наносять на спеціальні диски. Якщо відразу відбувається червоно-фіолетове забарвлення, то культура оксидазопозитивних. Для видової ідентифікації та диференціації від непатогенних нейссерий, що постійно живуть у верхніх дихальних шляхах використовують комплекс властивостей (таблиця 1).
Диференційовані властивості деяких видів роду Neisseria
Позначення: "+" - 90% і більше штамів позитивні;
"-" - 90% і більше штамів негативні;
d - 11-89% штамів позитивні.
Визначення антибіотикограми менінгококів здійснюється диско-дифузійним методом (ДДМ).
4етап.Учтіте та оцініть результати посіву досліджуваної культури на звичайний живильний агар, 2 пробірки з сироватковим агаром (37 ° С, 22 ° С), «строкатий ряд».
У ідентифікованих культур менінгококів визначають серогрупу в РА з типоспецифічними сироватками (А, В, С, D, 29E, 135W, X, Y, Z).
На підставі отриманих результатів, які внесіть в протокол, визначте видову приналежність культури, її чутливість до антибіотиків і зробіть висновок; заповніть бланк-направлення та бланк-відповідь з бак. лабораторії.
III. Промікроскопіруйте пофарбований за Грамом препарат з уретрального гною хворого з підозрою на гонорею. Дайте висновок.
При позитивному результаті в препараті виявляють гонококи - грамнегативні диплококи бобовидной форми знаходяться всередині лейкоцитів. Ця мікроскопічна картина спостерігається при гострій гонореї до застосування антибіотиків. При хронічній гонореї бактеріоскопічне дослідження дає негативний результат так як гонококи мають атипову форму, варіабельні в забарвленні по Граму і в препараті виявляють різноманітну сторонню мікрофлору.
IV. Врахуйте і оціните результати РСК з сироваткою хворого з підозрою на хронічну гонорею. Отримані результати занесіть в протокол і зробіть висновок (див. Заняття № 11).
V. Ознайомтеся і опишіть в протоколі бак. препарати: хімічна менінгококова вакцина А + С, агглютинирующие менінгококової сироватки, діагностичні менінгококової сироватки для латекс-аглютинації, гонококковая вакцина, гоноаллерген, вказавши, що вони містять, для чого і як застосовуються.
Питання для самоконтролю:
1. Правила забору і доставки виділень з задньої стінки носоглотки з метою діагностики менінгококового назофарингіту і носійства.
2. Обгрунтуйте можливість використання мікроскопічного методу діагностики при менінгококової інфекції.
3. Обгрунтуйте необхідність знання патогенезу менінгококової інфекції для обгрунтованого вибору матеріалу для мікробіологічної діагностики.
4. Обгрунтуйте вибір методів мікробіологічної діагностики при менінгококової назофарингіт, менінгококкеміі і епідемічному менінгококової менінгіті.
5. З якою метою проводиться серотіпірованіе виділеного збудника при менігококкових і гонококових інфекціях?
6. Назвіть метод мікробіологічної діагностики менігококкових і гонококових інфекцій, що дозволяє уточнити вибір препаратів для етіотропної терапії.
7. Назвіть методи експрес-діагностики менінгококової інфекцій, в чому їх суть?
8. Назвіть відмітні ознаки патогенних нейссерий від непатогенних.
9. Якого типу вакцини використовують для специфічної профілактики менінгококової інфекцій, тактика їх застосування.
10. Назвіть особливості мікробіологічної діагностики гострої і хронічної гонореї, обґрунтуйте вибір методів.
11. Призначення гоновакцини.
12. Призначення провокацій (біологічна, фізіологічна, аліментарна і ін.) При гонококових інфекціях.
Лекції по мікробіології.