Приготування мазків для бактеріоскопічного дослідження є вельми відповідальною процедурою, багато в чому зумовлює успіх дослідження. При цьому необхідно мати на увазі, що це одна з найнебезпечніших процедур. Туберкульоз поширюється повітряно-крапельним шляхом через дрібні крапельки розміром близько 5 мкм, що містять збудник, які при вдиханні в легенях можуть досягати альвеол і осідати в них, формуючи осередок інфекції. У лабораторній роботі зусилля повинні бути спрямовані на те, щоб уникнути або звести до мінімуму небезпеку зараження при тих маніпуляціях, при виконанні яких спостерігається найбільша небезпека розсіювання потенційно інфекційних аерозолів. Основними джерелами утворення таких аерозолів в лабораторіях є маніпуляції, які пов'язані з приготуванням мазків для бактеріоскопії:
- відкривання контейнерів з матеріалом; ця маніпуляція особливо небезпечна, якщо між зовнішньою стінкою шийки контейнера і внутрішньою поверхнею кришки знаходяться частинки висохлої мокроти або якщо безпосередньо перед відкриттям контейнер піддавався струшуванні;
- приготування мазків шляхом нанесення матеріалу на предметне скло і розподіл його по поверхні скла;
- пропалювання бактеріологічних петель, що використовуються для перенесення матеріалу на скло. При виконанні цих маніпуляцій слід дотримуватися особливої обережності.
Мазки для бактеріоскопічного дослідження готують з нативної необробленої мокротиння. Для цього мокроту переливають в чашку Петрі, під дно якої підкладена чорна папір. Поруч з чашкою поміщають два чистих (раніше не були в ужитку) і заздалегідь промаркованих предметних скла. За допомогою двох препаровальной голок, бактеріологічних петель або добре загострених дерев'яних паличок (для кожної проби мокротиння нових) вибирають 5-6 найбільш щільних гнійних грудочок мокротиння, переносять їх на скло, покривають зверху другим склом, злегка притискають і, розсовуючи скла в різні боки, розтирають до отримання рівномірного тонкого шару. Мазок повинен займати 2 / з- 3Л скла.
Під час приготування мазків слід дотримуватися максимальної обережності, щоб уникнути утворення бризок і виходу матеріалу за краї скла.
Приготовлені мазки поміщають на 15-30 хв на фільтрувальну папір для просушування при кімнатній температурі. Оскільки не завжди вдається уникнути попадання матеріалу на краю скла, то папір, на якій для просушування розкладають мазки, слід вважати зараженої. Висохлі скла пінцетом або спеціальними щипцями беруть за кінець, на якому нанесено маркування, і 3 рази проводять через полум'я спиртівки або газового пальника (загальна тривалість перебування мазка в полум'я не повинна перевищувати 3-5 с), а потім поміщають на чисту папір або спеціальний піднос .
З метою більшої безпеки мазки з мокроти можна робити з осаду після обробки матеріалу.
Мазки з рідкого патологічного матеріалу (Бронхоальвеолярний змиви, промивні води бронхів або шлунка, сеча, пунктати з закритих порожнин, ексудати і ін.) Готують з осаду матеріалу, отриманого після обробки його кислотою або лугом з подальшим відмиванням або нейтралізацією і центрифугуванням. Висушені і фіксовані мазки забарвлюють. При виборі забарвлення враховують метод мікроскопії, за допомогою якого буде здійснюватися бактеріоскопічне дослідження: звичайний світловий (масляна іммерсія) або люмінесцентний (флюоресцентная мікроскопія) мікроскоп.
Найбільш вживаним і поширеним методом забарвлення для виявлення кислотостійких мікобактерій є спосіб Циля-Нільсена. При одночасному впливі нагрівання і сильного протравлюючого речовини фенолу (карболової кислоти), на якому готується основне барвник фуксин, полегшується проникнення анілінового барвника в мікробну клітину і особливо в структури її клітинної стінки, що складається з ліпідів і міколових кислот. Звичайні анілінові барвники не сприймаються мікобактеріями, і останні не фарбуються. Подальше знебарвлення мазка в 29% розчині сірчаної кислоти або 3% розчині солянокислого спирту призводить до знебарвлення всіх некіслотоустойчівих структур. Тільки мікобактерій, що володіють вираженою кислото- і спиртостійкі, стійко утримують барвник і залишаються пофарбованими в червоний колір. Знебарвлені елементи мазка дофарбовують метиленовим синім. Мікобактерій виявляються в препараті у вигляді тонких, прямих або злегка вигнутих яскраво-червоних паличок, іноді розташованих під кутом у вигляді римської цифри V, часто купками або невеликими скупченнями. Нерідко в тілі паличок або окремо від них виділяються поодинокі темніші зерна або їх скупчення (зернисті форми).
При мікроскопії мазків слід враховувати широкий поліморфізм мікобактерій туберкульозу, особливо при дослідженні матеріалу від хворих, які отримують протитуберкульозні препарати. У зв'язку з тим що широке застосування хіміопрепаратів змінює морфологію мікобактерій, в ряді випадків при дослідженні препаратів можуть виявлятися і гіллясті форми нерівномірного ширини, і бліднокрашених палички, і осколки мікобактерій, і окремі кислотостійкі зерна або їх скупчення.
Крім того, в мазках з осаду сечі, промивних вод шлунка і іншого матеріалу поряд з мікобактеріями туберкульозу можуть виявлятися і кислотостійкі сапрофіти, зокрема в сечі - мікобактерій сперми, які легко сплутати з мікобактеріями туберкульозу. У сумнівних випадках рекомендується мазок тривалий час (45-60 хв) знебарвлювати в солянокислом спирті або жавеловой воді. При такому методі знебарвлення сапрофіти втрачають своє забарвлення і вигладять у вигляді паличок блакитного кольору (в результаті докрашіванія мазка після знебарвлення метиленовим синім).
Правильна мікроскопія препаратів є відповідальною процедурою і вимагає високої кваліфікації і великого досвіду мікроскопісти, так як на підставі результатів мікроскопії ставиться діагноз, уточнюються ефективність лікування і прогноз захворювання.
В останні роки досить широке поширення отримав метод люмінесцентної мікроскопії. Він заснований на відмінності світіння мікроскопіруемого об'єкта в ультрафіолетовому або короткохвильовому спектрі видимого світла. В основі застосування цього методу для диференціації мікобактерії туберкульозу лежить здатність ліпідів цих бактерій сприймати люмінесцентні барвники і потім світитися при опроміненні ультрафіолетовими променями. Залежно від застосовуваних барвників мікобактерії туберкульозу дають чітке яскраво-червоне свічення на зеленому тлі або золотисто-жовте - на темно-зеленому тлі. Цим методом можна досліджувати будь-який матеріал, крім сечі, в якій можуть бути сапрофіти, важко диференціюються при такій забарвленням. Останні мають зеленуватий або апельсиновий відтінок. Найбільш широко поширені методи забарвлення акридиновим помаранчевим по Адамчик і забарвлення аурамін-родаміном.