- Лизис клітин і клітинних мембран.
Клітини руйнують механічно або за допомогою ферментативної обробки. Мембрани руйнують обробкою детергентами (навпрімер, SDS) або хаотропнимі агентами (гуанидин ізотіаціанат).
Білки екстрагують сумішшю фенолу, хлороформу, ізоамілового спирту. Оскільки щільності цих органічних растворітлей відмінні від щільності води, при центрифугуванні лизата клітин, до якого були додані фенол і хлороформ, утворюється два окремих шари: нижній, що представляє собою розчин на основі органічних розчинників, і верхній, який містить водний розчин. При цьому білки денатурують і утворюють преципітат, який розташовується вузькою смугою на кордоні водної та органічної фаз. Якщо фенол був врівноваженим буфером з нейтральним значенням рН, то водна фаза буде містити відразу і ДНК, і РНК.
Якщо ж фенол був урівноважений буфером, що має кисле значення рН, то ДНК виявиться в нижньому, органічному шарі, а РНК - в верхньому, водному.
Використовують осадження ДНК етанолом (ізопрапанолом) в присутності солі (ацетату натрію) з подальшим відділенням осаду центрифугуванням і розчиненням осаду або адсорбцію ДНК на твердому носії (наприклад, скло) з подальшою елюція.
Виділення плазмідної ДНК
Для виділення плазмідної ДНК з клітин використовують лужний метод. В ході експерименту змінюють pH розчину, що містить геномної і плазмидную ДНК, на лужний. При такому значенні pH вся ДНК денатурує. Однак ланцюга двуцепочечной плазмідної ДНК при цьому залишаються пов'язаними один з одним, оскільки плазміди мають кільцеву форму. При подальшій ренатурації, яка ініціюється зміною pH розчину до початкового, довгі ланцюги геномної ДНК, встигнувши розійтися в розчині при денатурації, утворюють щільний неструктурований грудку, а ланцюга плазмідної ДНК успішно відновлюють первинну структуру. Тепер плазмидную ДНК легко відокремити від геномної ДНК в ході центрифугування.
