Досягнення в галузі молекулярної біології істотно вплинули на сучасну медицину: вони не тільки поглибили знання про причини багатьох хвороб, але і сприяли розробці нових підходів у їх діагностики та лікування.
Для виявлення дефектів в структурі ДНК вона повинна бути виділена з біологічного матеріалу та "скопійована" (напрацьована) в кількостях, достатніх для дослідження. Для генно-терапевтичних робіт необхідно виділення нормальних генів і введення їх в дефектні клітини таким чином, щоб вони експресуватися, дозволяючи відновити здоров'я пацієнта.
Виділення ДНК включає швидкий лізис клітин, видалення фрагментів клітинних органел і мембран за допомогою центрифугування, руйнування білків протеазами, екстрагування ДНК з подальшим її осадженням. В ході виділення отримують дуже великі молекули, їх додатково фрагментують за допомогою рестриктаз. Утворені фрагменти поділяють методом електрофорезу. Кількість і довжина виходять фрагментів, і відповідно, розташування смуг на електрофореграмме унікально і специфічно для кожної людини.
Ідентифікація характерних послідовностей проводиться методом блот-гібридизації за Саузерну. Фрагменти ДНК піддають денатурації і здійснюють перенесення (блот) на щільний носій (фільтр або мембрану). Фіксовану на фільтрі ДНК гибрідизуючою з невеликими фрагментами ДНК або РНК, що містять радіоактивну (флюоресцентную або ін.) Мітку. Такі фрагменти називають ДНК-або РНК-зондами. Якщо в досліджуваному зразку є послідовності, комплементарні послідовностям зонда, то гібридизацію можна визначити візуально або за допомогою спеціальних приладів. Метод застосовується для діагностики інфекційних захворювань, спадкових дефектів, встановлення експресії тих чи інших генів.
Секвенування (визначення первинної структури) ДНК проводиться хімічним або ензиматичними методом. Метод Маскама і Гілберта (хімічний) заснований на хімічній деградації ДНК. Суть методу зводиться до наступного: один з кінців фрагмента ДНК мітять за допомогою радіоактивної або флюоресцентной мітки. Препарат міченої ДНК ділять на чотири порції і кожну з них обробляють реагентом, що руйнує одне або два з чотирьох підстав, причому умови реакції підбирають таким чином, щоб на кожну молекулу ДНК доводилося лише кілька пошкоджень. В результаті виходить набір мічених фрагментів, довжини яких визначаються відстанню від зруйнованого підстави до кінця молекули. Фрагменти, що утворилися в усіх чотирьох реакціях, піддають електрофорезу в чотирьох сусідніх доріжках; потім проводять їх ідентифікацію. Відповідно до положення відбитків можна визначити, на якій відстані від міченого кінця знаходилося зруйноване підставу, а знаючи це підстава - його положення. Так набір смуг визначає нуклеотидну послідовність ДНК.
Метод Сенгера (ферментативний) заснований на моделюванні ДНК-полімеразної реакції, де досліджувана молекула ДНК використовується в якості матриці. У реакційну суміш додають дідезоксінуклеотіди (ОН-група в 3'-положенні пентози відсутня). ДНК-полімераза включає ці попередники в ДНК. Однак, включившись в ДНК, модифікований нуклеотид не може утворити фосфодіефірную зв'язок з наступним дезоксірібонуклеотідов. В результаті елонгація даному колі зупиняється в тому місці, де в ДНК включився дідезоксірібонуклеотід. Реакція проводиться одночасно в чотирьох окремих пробірках, кожна з яких містить один з чотирьох дідезоксінуклеотідов і все 4 дезоксінуклеотідтріфосфата (до них, як правило приєднують радіоактивну або флюоресцентную мітку). У кожній з пробірок утворюється набір мічених фрагментів різної довжини. Довжина їх залежить від того, в якому місці в ланцюг включений дефектний нуклеотид. Отримані мічені фрагменти ДНК розділяють в поліакриламідному гелі з точністю до одного нуклеотиду, проводять ідентифікацію і по картині розподілу фрагментів в чотирьох пробах встановлюють нуклеотидную послідовність ДНК.
Отримання рекомбінантних ДНК і їх ампліфікація. При отриманні рекомбінантних ДНК виділяють ці молекули з двох різних джерел. Кожну з них окремо фрагментують, використовуючи одну і ту ж рестріктази. Після процедури нагрівання і повільного охолодження суміші отриманих фрагментів, поряд з вихідними молекулами ДНК утворюються і рекомбінантні, що складаються з ділянок ДНК, спочатку належали різним зразкам. Використовуючи техніку рекомбінантних ДНК, вдається дослідити варіанти генів, відповідальних за розвиток багатьох захворювань. Цим способом можуть бути ідентифіковані різні мутації.
Для отримання значних кількостей рекомбінантного генетичного матеріалу проводять клонування ДНК, яка передбачає вбудовування потрібного фрагмента ДНК в векторну молекулу, Вектор забезпечує проникнення цієї рекомбінантної ДНК в бактеріальні клітини. При розмноженні трансформованих бактерій відбувається збільшення числа копій введеного фрагмента ДНК, а також синтез не властивих бактеріальної клітці, але вельми цінних для людини білкових продуктів. Таким способом одержують вакцини, інсулін, гормон росту, фактори згортання крові та ін.
Робота з нуклеотидними послідовностями вимагає наявності достатньої кількості матеріалу для дослідження. Тому фрагменти ДНК попередньо амплифицируют (збільшують кількість). Метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), запропонований в 1983 р Каррі Мулліс, дозволяє піддавати специфічною ампліфікації в умовах in vitro будь зразки ДНК.
Полімеразна ланцюгова реакція протікає в три стадії:
1. Денатурація.
Инкубационную суміш, в якій міститься зразок потрібної ДНК, нагрівають до температури 90 ° С. При цьому протягом 15 секунд відбувається руйнування слабких водневих зв'язків між нитками ДНК, і з однієї двухцепочечной молекули утворюється дві одноцепочечниє.
2. Гібридизація праймерів.
Температуру знижують до 50 ° С. При цьому відбувається гібридизація ланцюгів ДНК з праймерами. Ця стадія зазвичай протікає 30 секунд.
3. Полімеризація.
Инкубационную суміш нагрівають до 70 ° С. При такій температурі полімераза подовжує обидва праймера з їх 3'-решт. Праймери доростають до розмірів матриці. Цей процес протікає протягом 90 секунд. В результаті кількість ДНК подвоюється.
Процедуру проводять в автоматичному режимі в приладі - термоциклері (ціклізаторе, ампліфікаторі). Цей пристрій дозволяє задавати потрібну кількість циклів і вибирати оптимальні тимчасові і температурні параметри. За допомогою ПЛР можна отримати достатню кількість копій ділянок ДНК, в яких передбачаються присутність мутацій, поліморфізм сайтів, можна проводити ДНК-діагностику інфікованості пацієнтів вірусними, бактеріальними та грибковими збудниками хвороб.
Інші новини по темі: