Інгібітори матричних биосинтезов
Існує велика група речовин, що пригнічують синтез ДНК, РНК або білків. Деякі з них знайшли застосування в медицині для лікування інфекційних хвороб та пухлинних захворювань, а інші є для людини найсильнішими токсинами. До останніх можна віднести токсин блідої поганки # 945; -аманітін, який є інгібітором еукаріотичних РНК-полімерази.
Дія інгібіторів матричних биосинтезов як лікарських препаратів засноване на:
· Модифікації матриць (ДНК або РНК);
· Білоксинтезуючого апарату (рибосом);
Центральне місце серед них належить антибіотиків - різноманітним за хімічною будовою органічних сполук, що синтезуються мікроорганізмами. Короткі відомості про антибіотики, що пригнічують матричні синтези, наведені в таблиці 7.2.
Антибіотики - інгібіруюшіе матричні біосинтезу
Інгібітори реплікації і транскрипції
Дауноміцин Доксорубіцин Актіноміцини D
Вбудовуються між парами основ ДНК, блокують синтез ДНК і РНК у про- і еукаріот
Інгібують ДНК-топоізомеразу, відповідальну за суперспіралізацію ДНК
Зв'язуються з бактеріальної РНК-полімерази
Інгібують елонгацію: зв'язуються з 30S субодиницею рибосоми і блокують приєднання аа-тРНК в А-центр
Приєднується до 50S субодиниці рибосоми і пригнічує пептидилтрансферазної активність
Приєднується до 50S субодиниці рибосоми і пригнічує транслокацию
Пригнічує ініціацію трансляціі.Связивается з 50S субодиницею рибосоми, викликає помилки в прочитанні інформації, закодованої в мРНК
Досягнення в галузі молекулярної біології істотно вплинули на сучасну медицину: вони не тільки поглибили знання про причини багатьох хвороб, але і сприяли розробці нових підходів у їх діагностики та лікування.
Для виявлення дефектів в структурі ДНК вона повинна бути виділена з біологічного матеріалу та "скопійована" (напрацьована) в кількостях, достатніх для дослідження. Для генно-терапевтичних робіт необхідно виділення нормальних генів і введення їх в дефектні клітини таким чином, щоб вони експресуватися, дозволяючи відновити здоров'я пацієнта.
Виділення ДНК включає швидкий лізис клітин, видалення фрагментів клітинних органел і мембран за допомогою центрифугування, руйнування білків протеазами, екстрагування ДНК з подальшим її осадженням. В ході виділення отримують дуже великі молекули, їх додатково фрагментують за допомогою рестриктаз. Утворені фрагменти поділяють методом електрофорезу. Кількість і довжина виходять фрагментів, і відповідно, розташування смуг на електрофореграмме унікально і специфічно для кожної людини.
Ідентифікація характерних послідовностей проводиться методом блот-гібридизації за Саузерну. Фрагменти ДНК піддають денатурації і здійснюють перенесення (блот) на щільний носій (фільтр або мембрану). Фіксовану на фільтрі ДНК гибрідизуючою з невеликими фрагментами ДНК або РНК, що містять радіоактивну (флюоресцентную або ін.) Мітку. Такі фрагменти називають ДНК-або РНК-зондами. Якщо в досліджуваному зразку є послідовності, комплементарні послідовностям зонда, то гібридизацію можна визначити візуально або за допомогою спеціальних приладів. Метод застосовується для діагностики інфекційних захворювань, спадкових дефектів, встановлення експресії тих чи інших генів.
Секвенування (визначення первинної структури) ДНК проводиться хімічним або ензиматичними методом. Метод Маскама і Гілберта (хімічний) заснований на хімічній деградації ДНК. Суть методу зводиться до наступного: один з кінців фрагмента ДНК мітять за допомогою радіоактивної або флюоресцентной мітки. Препарат міченої ДНК ділять на чотири порції і кожну з них обробляють реагентом, що руйнує одне або два з чотирьох підстав, причому умови реакції підбирають таким чином, щоб на кожну молекулу ДНК доводилося лише кілька пошкоджень. В результаті виходить набір мічених фрагментів, довжини яких визначаються відстанню від зруйнованого підстави до кінця молекули. Фрагменти, що утворилися в усіх чотирьох реакціях, піддають електрофорезу в чотирьох сусідніх доріжках; потім проводять їх ідентифікацію. Відповідно до положення відбитків можна визначити, на якій відстані від міченого кінця знаходилося зруйноване підставу, а знаючи це підстава - його положення. Так набір смуг визначає нуклеотидну послідовність ДНК.
Метод Сенгера (ферментативний) заснований на моделюванні ДНК-полімеразної реакції, де досліджувана молекула ДНК використовується в якості матриці. У реакційну суміш додають дідезоксінуклеотіди (ОН-група в 3'-положенні пентози відсутня). ДНК-полімераза включає ці попередники в ДНК. Однак, включившись в ДНК, модифікований нуклеотид не може утворити фосфодіефірную зв'язок з наступним дезоксірібонуклеотідов. В результаті елонгація даному колі зупиняється в тому місці, де в ДНК включився дідезоксірібонуклеотід. Реакція проводиться одночасно в чотирьох окремих пробірках, кожна з яких містить один з чотирьох дідезоксінуклеотідов і все 4 дезоксінуклеотідтріфосфата (до них, як правило приєднують радіоактивну або флюоресцентную мітку). У кожній з пробірок утворюється набір мічених фрагментів різної довжини. Довжина їх залежить від того, в якому місці в ланцюг включений дефектний нуклеотид. Отримані мічені фрагменти ДНК розділяють в поліакриламідному гелі з точністю до одного нуклеотиду, проводять ідентифікацію і по картині розподілу фрагментів в чотирьох пробах встановлюють нуклеотидную послідовність ДНК.
Отримання рекомбінантних ДНК і їх ампліфікація. При отриманні рекомбінантних ДНКвиделяют ці молекули з двох різних джерел. Кожну з них окремо фрагментують, використовуючи одну і ту ж рестріктази. Після процедури нагрівання і повільного охолодження суміші отриманих фрагментів, поряд з вихідними молекулами ДНК утворюються і рекомбінантні, що складаються з ділянок ДНК, спочатку належали різним зразкам. Використовуючи техніку рекомбінантних ДНК, вдається дослідити варіанти генів, відповідальних за розвиток багатьох захворювань. Цим способом можуть бути ідентифіковані різні мутації.
Для отримання значних кількостей рекомбінантного генетичного матеріалу проводять клонування ДНК. передбачає вбудовування потрібного фрагмента ДНК в векторну молекулу, Вектор забезпечує проникнення цієї рекомбінантної ДНК в бактеріальні клітини. При розмноженні трансформованих бактерій відбувається збільшення числа копій введеного фрагмента ДНК, а також синтез не властивих бактеріальної клітці, але вельми цінних для людини білкових продуктів. Таким способом одержують вакцини, інсулін, гормон росту, фактори згортання крові та ін.
Робота з нуклеотидними послідовностями вимагає наявності достатньої кількості матеріалу для дослідження. Тому фрагменти ДНК попередньо амплифицируют (збільшують кількість). Метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). запропонований в 1983 р Каррі Мулліс, дозволяє піддавати специфічною ампліфікації в умовах in vitro будь зразки ДНК.
Полімеразна ланцюгова реакція протікає в три стадії:
Инкубационную суміш, в якій міститься зразок потрібної ДНК, нагрівають до температури 90 ° С. При цьому протягом 15 секунд відбувається руйнування слабких водневих зв'язків між нитками ДНК, і з однієї двухцепочечной молекули утворюється дві одноцепочечниє.
Инкубационную суміш нагрівають до 70 ° С. При такій температурі полімераза подовжує обидва праймера з їх 3'-решт. Праймери доростають до розмірів матриці. Цей процес протікає протягом 90 секунд. В результаті кількість ДНК подвоюється.
5 '3' 3 '5' 5 '3' 3 '5'
Рис.7.2. Схема полімеразної ланцюгової реакції
Процедуру проводять в автоматичному режимі в приладі - термоциклері (ціклізаторе, ампліфікаторі). Цей пристрій дозволяє задавати потрібну кількість циклів і вибирати оптимальні тимчасові і температурні параметри. За допомогою ПЛР можна отримати достатню кількість копій ділянок ДНК, в яких передбачаються присутність мутацій, поліморфізм сайтів, можна проводити ДНК-діагностику інфікованості пацієнтів вірусними, бактеріальними та грибковими збудниками хвороб.
глава 8
ВСТУП В МЕТАБОЛІЗМ
Обмін речовин або метаболізм - це сукупність хімічних реакцій в організмі, які забезпечують його речовинами і енергією, необхідними для життєдіяльності. Процес метаболізму, що супроводжується утворенням більш простих з'єднань зі складних, позначають терміном - катаболізм. Процес, що йде в зворотному напрямку і приводить, в кінцевому рахунку, до утворення складного продукту з відносно більш простих - анаболізм. Анаболічні процеси супроводжуються споживанням енергії, катаболіческіе - вивільненням.
Анаболизм і катаболізм не є простим зверненням реакцій. Анаболічні шляхи повинні відрізнятися від шляхів катаболізму хоча б однієї з ферментативних реакцій, щоб регулюватися незалежно, і за рахунок контролю активності цих ферментів регулюється сумарна швидкість розпаду і синтезу речовин. Ферменти, які визначають швидкість всього процесу в цілому, називаються ключовими.
Більш того, шлях по якому йде катаболізм тієї чи іншої молекули, може бути непридатним для її синтезу з енергетичних міркувань. Наприклад, що протікають в печінці розщеплення глюкози до пірувату є процес, що складається з 11 послідовних стадій, що каталізують специфічними ферментами. Здавалося б, синтез глюкози з пірувату повинен бути простим зверненням всіх цих ферментативних стадій її розпаду. Такий шлях представляється на перший погляд і найприроднішим, і найбільш економічним. Однак насправді біосинтез глюкози (глюконеогенез) в печінці протікає інакше. Він включає лише 8 з 11 ферментативних стадій, що беруть участь в її розпаді, а 3 відсутні стадії замінені в ньому зовсім іншим набором ферментативних реакцій, властивим тільки цьому биосинтетической шляху. Крім того, реакції катаболізму і анаболізму часто розділені мембранами і протікають в різних компартментах клітин.
Компартменталізація деяких метаболічних шляхів в гепатоците
Гліколіз, багато реакції глюконеогенезу, активація амінокислот, синтез жирних кислот
Цикл трикарбонових кислот, ланцюг тканинного дихання, окислення жирних кислот, окисне фосфорилювання
Метаболізм виконує 4 функції:
1) постачання організму хімічної енергією, отриманої при розщепленні багатих енергією харчових речовин;
2) перетворення харчових речовин в будівельні блоки, які використовуються в клітці для біосинтезу макромолекул;
3) Cборка макромолекулярних (біополімери) і надмолекулярних структур живого організму, пластичне та енергетичне підтримку його структури;
4) синтез і руйнування тих біомолекул, які необхідні для виконання специфічних функцій клітини і організму.
Метаболічний шлях - це послідовність хімічних перетворень конкретного речовини в організмі. Проміжні продукти, що утворюються в процесі перетворення, називають метаболітами. а останнім з'єднання метаболічного шляху - кінцевим продукт. Прикладом метаболічного шляху є гліколіз, синтез холестерину.
Метаболічний цикл - це такий метаболічний шлях, один з кінцевих продуктів якого ідентичний одному із з'єднань залучених в цей процес. Найбільш важливими в організмі людини метаболічними циклами є цикл трикарбонових кислот (цикл Кребса) і орнітіновий цикл мочевінообразованія.
Майже всі метаболічні реакції в кінцевому підсумку пов'язані між собою, оскільки продукт однієї ферментативної реакції служить субстратом для іншої, яка в даному процесі відіграє роль наступної стадії. Таким чином, метаболізм можна представити у вигляді надзвичайно складної мережі ферментативних реакцій. Якщо потік поживних речовин в який-небудь однієї частини цієї мережі зменшиться або порушиться, то у відповідь можуть відбутися зміни в іншій частині мережі, для того щоб це перша зміна було якось врівноважено або скомпенсировано. Більш того, і катаболические і анаболічні реакції відрегульовані таким чином, щоб вони протікали найбільш економічно, тобто з найменшою витратою енергії і речовин. Наприклад, окислення поживних речовин в клітині відбувається зі швидкістю, як раз достатньою для того, щоб задовольнити її енергетичні потреби в даний момент.