Забарвлення мікроорганізмів - найбільш поширений в мікробіології комплекс методів і прийомів, що застосовується для виявлення та ідентифікації мікроорганізмів за допомогою мікроскопа. У нативному (природному) стані бактерії мають такий же коефіцієнт заломлення, як і скло, тому вони невидимі при мікроскопічному дослідженні. Забарвлення мікроорганізмів дозволяє вивчити морфологічні особливості мікробів, а іноді точно визначити їх вид, наприклад деякі мікроби - однакові по морфології - по-різному забарвлюються за допомогою одних і тих же складних методів забарвлення. Забарвлення мікроорганізмів являє собою фізико-хімічний процес з'єднання хімічних компонентів клітини з фарбою. У ряді випадків різні частини мікробної клітини (ядро, цитоплазма) вибірково фарбуються різними барвниками. Найбільш придатними для забарвлення мікроорганізмів є анілінові фарби, головним чином основні і нейтральні, кислі фарби менш придатні.
Приготування забарвленого препарату включає ряд етапів: 1) приготування мазка; 2) висушування мазка; 3) фіксацію мазка; 4) забарвлення; 5) висушування.
Мазок готують на чистих предметних стеклах, на середину яких завдають невелику краплю води і в неї за допомогою бактеріологічної петлі поміщають досліджуваний матеріал. Матеріал розподіляють на склі рівномірним тонким шаром, розмір мазка -1-2 см 2.
Препарат зазвичай висушують при кімнатній температурі на повітрі. Для прискорення висушування допускається підігрівання мазка в струмені теплого повітря високо над полум'ям пальника.
Висушений мазок піддається фіксації, при якій мазок прикріплюється до скла (фіксується), а мікроби стають більш сприйнятливими до фарбування. Способів фіксації багато. Найбільш простий і поширений - фіксація жаром - нагрівання на полум'ї пальника (препарат проводять кілька разів через найбільш гарячу частину полум'я пальника). У ряді випадків вдаються до фіксації рідинами (етиловий або метиловий спирт, ацетон, суміш рівних обсягів спирту та ефіру - по Никифорову). Після фіксації мазок забарвлюють. Кількість фарби, що наноситься на препарат, має бути таким, щоб покрити всю поверхню мазка. Після закінчення терміну фарбування (2-5 хв.) Фарбу зливають і препарат промивають водою.
Існують прості, складні і диференціальні способи фарбування мікробів. При простій забарвленні зазвичай вживають одну фарбу, найчастіше червону - фуксин, або синю - метиленовий синій. Фуксин фарбує швидше (1-2 хв.), Метиленовий синій - повільніше (3-5 хв.). Фуксин готують у вигляді концентрованого карболового розчину (фуксин Ціля), дуже стійкого і придатного для забарвлення протягом багатьох місяців. Метиленовийсиній готується заздалегідь в насиченому спиртовому розчині, який стійкий і може довго зберігатися.
Складні способи забарвлення, при яких застосовуються два або більше барвника, є цінними методами, використовуваними в мікробіологічної діагностики інфекційних хвороб.
Найбільше практичне значення має забарвлення по Граму (див. Грома метод забарвлення) і фарбування за Цілем.
Метод забарвлення за Цілем є основним для забарвлення кислотостійких бактерій. Тут застосовуються два барвника: карболовий фуксин Ціля і метиленовий синій. Кислотостійкі бактерії забарвлюються в червоний колір, все некіслотоустойчівие форми - в синій.
Метод Беніньетті є одним із способів забарвлення джгутиків. Протрава і забарвлення одним з фарбувальних розчинів, що складаються ex tempore (у міру потреби): I - сульфат цинку - 1 г, танін - 10 г, дистильована вода - 100 мл і II - насичений спиртовий розчин генціанвіолета. Змішують 5 мл розчину I і 3 мл розчину II, наносять на препарат, нагрівають до появи парів, промивають водою, висушують і розглядають.
З інших складних методів застосовується так званий негативний спосіб Бурри (див. Бурри метод), спосіб Гінса для виявлення капсул (див. Гінса метод) і ряд інших. Див. Також Бактеріологічне дослідження.
Забарвлення мікроорганізмів - комплекс методів вивчення структури і морфології мікроорганізмів при мікроскопії препаратів, приготованих з чистих культур або досліджуваного матеріалу. Забарвлення мікроорганізмів - важливий діагностичний прийом, що дозволяє встановити морфологічні особливості мікроба, а також розрізнити морфологічно ідентичні мікроорганізми, які по-різному фарбуються при використанні одних і тих же методів забарвлення.
Забарвлення мікроорганізмів - складний фізико-хімічний процес, механізм якого в деталях ще не вивчений. В основі забарвлення мікроорганізмів лежить взаємодія окремих структур бактерії з барвником. Отже, результат забарвлення мікроорганізмів залежить від хімічного і фізичного будови мікробів, властивостей барвника, способу приготування препарату і методу обробки їм мікроба. Для забарвлення мікроорганізмів використовують основні, кислі і нейтральні барвники. У основних барвників забарвлює початком служить катіон, а аніон безбарвний; у кислих, навпаки, барвна частина молекули є аніоном. Утворені при дисоціації основних барвників катіони з'єднуються зі структурами бактерій, що володіють кислими властивостями; звільняються аніони кислих барвників з'єднуються зі структурами мікроорганізму, що мають основні властивості.
У звичайних середовищах бактерії мають негативний поверхневий заряд, в їх цитоплазмі і ядрі є сполуки кислої природи. Тому основні барвники, у яких барвна частина молекули заряджена позитивно, мають більшу спорідненість до бактерії і частіше застосовуються в мікробіології, ніж кислі барвники, які зазвичай використовуються для контрастного фарбування фону препарату. У нейтральних барвників фарбувальними є і катіони, і аніони (фарба Романовського - Гимзе).
Фіксовані бактерії забарвлюються краще живих, так як клітинна стінка і цитоплазматична мембрана живої клітини обмежують проникнення в неї барвника. Для вітальної забарвлення мікроорганізмів (забарвлення живих мікроорганізмів) барвники застосовують у великих розведеннях (1:10 000- 1: 100 000), щоб уникнути артефактів, що з'являються в результаті токсичної дії барвника на живі мікроорганізми. Найчастіше для вітальної забарвлення мікроорганізмів користуються метиленовим сіпім, нейтральним червоним і ін. Препарати для мікроскопії готують методом роздавленої краплі. (Див.) Або висячої краплі (див.).
Найбільш поширені методи забарвлення мікроорганізмів в фіксованих препаратах. Ці методи поділяють на прості і складні. При простих методах застосовують один барвник (наприклад, забарвлення метиленовим синім, фуксином Пфейфера і ін.). При складних методах застосовують кілька барвників і дослідження включає кілька етапів фізичної і хімічної обробки препарату (див. Грама метод забарвлення, забарвлення за Цілем - Нельсену - см. Туберкульоз; забарвлення по. Романовським - Гімзою - см. Кров і ін.). Складні методи забарвлення мікроорганізмів використовують у мікробіологічної діагностики для вивчення будови і функцій мікроорганізмів. Наприклад, за допомогою забарвлення по Граму диференціюють грампозитивні мікроби від грамнегативних, що має велике значення для ідентифікації гонококів, менінгококів, кишкових бактерій і ін. Методом Циля - Нельсена; користуються для діагностики туберкульозу і прокази, методом Ненесера - дифтерії.
Як приклад використання забарвлення мікроорганізмів для вивчення будови і функцій мікроорганізмів можна вказати на застосування йоду для виявлення крохмалю, вікторії синьою - для виборчої забарвлення клітинної стінки і цітоплазматііческой мембрани бактерій, осмієвою кислоти - для забарвлення жиру і т. Д. Ці методи засновані на відмінностях в хімічному будову окремих морфологічних структур мікроба, вибірково офарблюються різними барвниками.
Інші методи забарвлення окремих структур мікроорганізмів засновані на здатності цих структур по-різному фіксувати барвники, що виявляється при подальшій обробці препарату спиртом, кислотою, ацетоном і ін. І докрашіваніі контрастним барвником. Так, для виявлення спор використовують їх властивість міцно фіксувати барвник і не знебарвлюватися при подальшій обробці кислотою. При фарбуванні бактерій за Грамом основними барвниками (генціановий фіолетовий і ін.) З наступною обробкою йодом в одних мікроорганізмах (грампозитивні) барвник міцно фіксується і не видаляється при обробці спиртом або ацетоном; грамнегативні ж бактерії легко знебарвлюються. Для виявлення в бактеріях нуклеоида застосовують метод Фейльгена. Від забарвлення у власному розумінні слід відрізняти імпрегнацію солями металів, наприклад імпрегнацію солями срібла при фарбуванні спирохет за методом Левадіті (див. Сифіліс).
Крім позитивних методів забарвлення (барвник безпосередньо діє на офарблює субстрат), в мікробіології використовують і негативні методи - фарбування фону препарату. Вони застосовуються в разі, коли мікроби або їх окремі структури погано фарбуються. Класичним прикладом негативного забарвлення є Бурри метод (див.). У тих випадках, коли необхідно виявити у мікроорганізму капсулу і пофарбувати сам мікроб, негативні і позитивні методи комбінують (див. Гінса метод).
Існує також кілька способів підвищення ефективності забарвлення. Одні з них створюють умови для проникнення барвника всередину окрашиваемого об'єкта (наприклад, при фарбуванні суперечка препарати попередньо обробляють соляною кислотою). Інші методи, пов'язані із застосуванням протрав, призводять до збільшення окрашиваемого об'єкта [наприклад, застосування солей таніновою кислоти для забарвлення джгутиків у бактерій (див. Беніньетті метод), тілець Пашена - за методом Морозова і клітинної стінки - по методу Нейз].
Див. Також Бактеріологічна техніка, Бактеріологічне дослідження.