Цілі і методи виділення чистих культур
Чистої культурою називають таку культуру, яка містить мікроорганізми одного виду [7, с. 64].
Виділення чистих культур бактерій - обов'язковий етап бактеріологічного дослідження в лабораторній діагностиці інфекційних хвороб, у вивченні мікробної забрудненості різних об'єктів навколишнього середовища, і, в цілому, при будь-якій роботі з мікроорганізмами [7, с. 64].
Досліджуваний матеріал (гній, мокротиння, фекалії, кров і інший матеріал від хворих; вода, грунт, повітря, харчові продукти, трупи тварин і людини, переносники) зазвичай містить асоціації мікробів.
Виділення чистої культури дозволяє вивчити морфологічні, культуральні, біохімічні, антигенні та інші ознаки, за сукупністю яких визначається видова і типова приналежність збудника, тобто проводиться, його ідентифікація.
Для виділення чистих культур мікроорганізмів використовують методи, які можна розділити на кілька груп [7, с. 64].
Метод Пастера - послідовне розведення досліджуваного матеріалу в рідкому поживному середовищі до концентрації однієї клітини в обсязі (має історичне значення).
Метод Коха ( «пластинчасті розводки») - послідовне розведення досліджуваного матеріалу в розплавленому агарі (температура 48-50 ° С), з подальшим розливом в чашки Петрі, де агар застигає.
Висіву роблять, як правило, з трьох-чотирьох останніх розведень, де бактерій стає мало і, в подальшому, при зростанні на чашках Петрі з'являються ізольовані колонії, які утворюються з однієї вихідної материнської клітини. З ізольованих колоній в глибині агару отримують чисту культуру бактерій пересівом на свіжі середовища.
Метод Шукевича - застосовується для отримання чистої культури протея та інших мікроорганізмів володіють «повзучим» ростом. Посів досліджуваного матеріалу виробляють в конденсаційну воду біля основи скошеного агару. Рухливі мікроби (протей) здатні підніматися вгору по скошеного агару, нерухомі форми залишаються рости внизу на місці посіву. Пересіваючи верхні краї культури можна отримати чисту культуру.
Метод Дрігальского - широко застосовується в бактеріологічній практиці, при цьому досліджуваний матеріал розводять в пробірці стерильним фізіологічним розчином або бульйоном.
Одну краплю матеріалу вносять в першу чашку і стерильним скляним шпателем розподіляють по поверхні середовища. Потім цим же шпателем (НЕ пропалюючи його в полум'я пальника) роблять такий же посів у другій і третій чашках. З кожним посівом бактерій на шпателі залишається все менше і менше і, при посіві на третю чашку, бактерії будуть розподілятися по поверхні живильного середовища окремо один від одного.
Через 1-7 діб. витримування чашок в термостаті (в залежності від швидкості росту мікроорганізмів) на третій чашці кожна бактерія дає клон клітин, утворюючи ізольовану колонію, яку пересівають на скошений агар з метою накопичення чистої культури.
Особливі труднощі виникають при виділенні чистих культур облігатних анаеробів. Якщо контакт з молекулярним киснем не викликає відразу ж загибелі клітин, то посів роблять за методом Дрігальского, але після цього чашки відразу поміщають в анаеростатах. Однак, частіше користуються методом розведення. Сутність його полягає в тому, що розведення досліджуваного матеріалу проводять в розплавленої та охолодженої до 45-50 ° С агарізірованной живильному середовищі.
Роблять 6-10 послідовних розведень, потім середу в пробірках швидко охолоджують і заливають поверхню шаром суміші парафіну і вазелінового масла, щоб перешкодити проникненню повітря в товщу живильного середовища. Іноді живильне середовище після посіву і перемішування переносять в стерильні трубки Бурри або капілярні піпетки Пастера, кінці яких запаюють.
При вдалому розведенні в пробірках, трубках Бурри, піпетках Пастера виростають ізольовані колонії анаеробів.
Щоб ізольовані колонії добре було видно, використовують прояснені поживні середовища. Для вилучення ізольованих колоній анаеробів, пробірку злегка нагрівають, обертаючи її над полум'ям, при цьому агар, що прилягає до стінок, плавиться і вміст пробірки у вигляді агарного стовпчика вислизає в стерильну чашку Петрі. Стовпчик агару розрізають стерильним пінцетом і витягають колонії петлею. Витягнуті колонії поміщають в рідку середу, сприятливу для розвитку виділяються мікроорганізмів (наприклад, середу Кітт-Тароцці). Агарізірованную середу з трубки Бурри видувають, пропускаючи газ через ватяну пробку.
Метод Хангейта - коли хочуть отримати ізольовані колонії бактерій з особливо високою чутливістю до кисню (строгі аероби) використовують метод обертових пробірок Хангейта.
Для цього розплавлену агарізірованную середу засівають бактеріями при постійному струмі через пробірку інертного газу, звільненого від домішки кисню. Потім пробірку закривають гумовою пробкою і поміщають горизонтально в затиск, що обертає пробірку, середа при цьому рівномірно розподіляється по стінках пробірки і застигає тонким шаром. Застосування тонкого шару в пробірці, заповненої газовою сумішшю, дозволяє отримати ізольовані колонії, що абсолютно очевидно неозброєним оком.
Виділення окремих клітин за допомогою мікроманіпулятора. Мікроманіпулятор - прилад, що дозволяє за допомогою спеціальної микропипетки або мікропетлі витягувати одну клітку з суспензії. Цю операцію контролюють під мікроскопом. На предметному столику мікроскопа встановлюють вологу камеру, в яку поміщають препарат «висяча крапля» [7, с. 70].
У власниках операційних штативів закріплюють микропипетки (мікропетлі), переміщення яких в поле зору мікроскопа здійснюється з мікронною точністю завдяки системі гвинтів і важелів. Дослідник, дивлячись в мікроскоп, витягує окремі клітини мікропіпетку і переносить їх в пробірки зі стерильною рідкої середовищем для отримання клону клітин.
Основним методом є бактеріологічний метод, який полягає у виділенні чистої культури збудника (популяції, що містить бактерії одного виду) і її ідентифікації.
Під ідентифікацією мікроорганізмів мають на увазі вивчення їх властивостей з метою встановлення приналежності до тієї чи іншої систематичної групи (роду, виду).
Бактеріологічний метод є багатоетапний дослідження. У зв'язку з тим, що досліджуваний матеріал найчастіше містить суміш мікроорганізмів, основою бактеріологічного методу є виділення чистої культури збудника, яке виробляють на першому етапі дослідження. З цією метою роблять посів досліджуваного матеріалу, як правило, на щільні поживні середовища, вибір яких обумовлюється властивостями передбачуваного збудника.
Застосовують по можливості елективні середовища, на яких росте тільки даний вид бактерій, або диференційно-діагностичні середовища, що дозволяють відрізнити передбачуваного збудника від інших мікроорганізмів.
Наприклад, для виділення дифтерійної палички використовують телуритовий середовища, при бактеріологічної діагностики кишкових інфекцій - середовище Ендо, вісмут-сульфітний агар.
При виділенні умовно-патогенних мікроорганізмів посів матеріалу виробляють на універсальні поживні середовища, наприклад, кров'яний агар. Всі маніпуляції, пов'язані з посівом і виділенням бактеріальних культур, здійснюють над полум'ям пальника.
Посів матеріалу на поживні середовища проводять або бактеріальної петлею, або скляним або металевим шпателем таким чином, щоб розсіяти знаходяться в досліджуваному матеріалі бактерії по поверхні живильного середовища, в результаті чого кожна бактеріальна клітка потрапляє на свою ділянку середовища. При виділенні чистої культури збудника з патологічного матеріалу, значною мірою забрудненого сторонньої мікрофлорою, іноді користуються біологічним методом виділення чистої культури: досліджуваним матеріалом заражають чутливих до збудника лабораторних тварин.