Експресії молекул КЛІТИННОЇ АДГЕЗІЇ КАДГЕРІНОВОГО КОМПЛЕКСУ ТА ЇХ РОЛЬ В ДІАГНОСТИЦІ при аутоімунних бульозні дерматози
Махнева Н.В. 1 Білецька Л.В. 2
1 ГУ Московський обласний науково-клінічний дослідний інститут ім. М.Ф. Володимирського, Москва
2 ФГУ «Федеральний науковий центр трансплантології і штучних органів ім. ак. В.І. Шумакова »Мінздоровсоцрозвитку Росії, Москва
Кадгерінов представляють собою різноманітну групу кальцій-залежних глікозильованих протеїнів. Аномалія експресії або дисфункція цих молекул, призводять до серйозних деструктивних наслідків. При аутоімунних бульозних дерматозах виявлено порушення ступеня експресії кадгерінового комплексу аж до його зникнення з нормальною локалізації і поява збоченій його експресії в зоні базальної мембрани епідермісу. Виявлені зміни експресії і локалізації кадгерінов свідчать про те, що під дією етіологічних і патогенетичних факторів відбувається перемикання функції одних генів на інші гени, тобто при придушенні одних і активації інших. Отримані відомості можуть бути використані в якості додаткових діагностичних маркерів в диференціальної діагностики аутоімунних бульозних дерматозів.
непрямий метод імунофлюоресценції
аутоімунні бульозні дерматози
3. Mice lacking desmocollin 1 show epidermal fragility accompanied by barrier defects and abnormal differentia-
tion / M. Chidgey, C. Brakebusch, E. Gustafsson, A. Cruchley, C. Haill, S. Kirk, A. Mernitt, A. North, C. Tselepis, J. Hewitt //
Кадгерінов є найбільш різноманітну групу кальцій-залежних глікозильованих протеїнів. Вони беруть участь головним чином в міжклітинних взаємодіях, що забезпечують адгезію між двома ідентичними молекулами, які експресувати на поверхні двох клітин одного і того ж типу [2, 5]. Цитоплазматичний домен цих молекул відіграє важливу роль в зв'язку з протеїнами цитоскелета, сприяючи збереженню форми клітин [6]. Крім фізичного контакту, який забезпечують кадгерінов між двома клітинами, вони сприяють передачі ряду сигналів через структури цитоскелета, контролюючи зростання і диференціювання клітин [5]. У шкірі молекули адгезії забезпечують складну організацію, залучаючи епітелій, дерму, судини, нерви, залози. І будь-які зміни, пов'язані з аномалією експресії або дисфункцією цих молекул, можуть привести до серйозних деструктивних наслідків [2, 3, 9].
Метою дослідження було визначення ступеня експресії кадгерінового комплексу при аутоімунних бульозних дерматозах і можливості використання отриманих даних в якості додаткового діагностичного маркера при даних захворюваннях.
Матеріал і методи дослідження
Робота виконана на підставі клінічного обстеження та вивчення матеріалу біопсії шкіри хворих аутоімунними бульозні дерматози.
Вивчення ступеня експресії кадгерінового комплексу проведено непрямим методом імунофлюоресценції з використанням моноклональних антитіл (МКАТ) миші проти кадгерінового комплексу, anti-pan cadherin (SIGMA, США) на 47 біоптатах клінічно інтактних ділянок шкіри і биоптатах уражених ділянок шкіри 45 хворих, з яких 23 хворих аутоімунної пузирчаткой (11 хворих вульгарною пухирчатка, 9 - себорейной пузирчаткой, один хворий вегетирующей пузирчаткой, один - листоподібною пузирчаткой, один - пранеопластіческой пузирчаткой), 16 хворих бульозним пемфігоїд, 2 - лінійним IgA-залежним бульозним дерматозом, 4 - придбаним бульозним епідермолізом. В якості контролю використовували кріостатних зрізи різних видів тканин. Зрізи шкіри практично здорових осіб, хворих, які страждають дилатаційною кардіоміопатією, зрізи нирок людини і зрізи серця бика. При цьому експресія кадгерінового комплексу була виявлена в міжклітинних просторах базального і шипуватий шарів епідермісу (рисунок a), волосяного фолікула, в стінці артеріол дерми, у вставних пластинках кардіоміоцитів, в місцях міжклітинних контактів ниркових канальців і клубочків.
Під місцевою анестезією 2,0% -м розчином новокаїну проводилася біопсія шкіри (з уражених і клінічно уражених ділянок) розміром 0,5 × 0,5 см. Шматочки тканин заморожували при -20 ° С. Серійні кріостатних зрізи товщиною 4-5 мкм готували в мікротом-криостате (-20 ° С) і використовували в фіксованому вигляді (в 100% -м холодному (4 ° С) ацетоні протягом 10 хв). Потім зрізи промивали фізіологічним розчином з фосфатним буфером (PBS), pH 7,0-7,4, протягом 3-5 хв. При нанесенні МКАТ на зрізи препарати витримували протягом 18 год при 4 ° С у вологій камері. Після промивання протягом 3-5 хв PBS (pH 7,0-7,4) зрізи обробляли люминесцирующей сироваткою проти імуноглобулінів миші ((НДІ епідеміології та мікробіології ім. Н.Г.Гамалеі АМН РФ; ІМТЕК, Москва) протягом 50- 60 хв у вологій камері в термостаті при 37,0-37,2 ° с, знову промивали PBS 3-5 хв і укладали під покривне скло в 60% -й нейтральний гліцерин. Досліджували препарати за допомогою люмінесцентного мікроскопа LEITZ LABORLUX S (LEIKA) . Препарати фотографували на плівку РФ-3 з об'єктивом х40 і окуляр-гомалем х3.
Частина зрізів використовували в нефіксованому вигляді з метою виявлення фіксованого імуноглобуліну в міжклітинних просторах і в зоні базальної мембрани епідермісу при аутоімунної пузирчатке і аутоімунних бульозних дерматозах з ураженням дермо-епідермального з'єднання (бульозний пемфігоїд, лінійний IgA-залежний бульозні дерматози, придбаний бульозний епідермоліз) відповідно. Кріостатних зрізи, фіксовані 96 ° етанолом, фарбували гематоксиліном і еозином з метою морфологічного контролю.
Результати дослідження та їх обговорення
При дослідженні як клінічно інтактних, так і уражених ділянок шкіри 23 хворих з різними формами пухирчатки виявлено порушення експресії кадгерінового комплексу. Так, у всіх досліджених 11 випадках вульгарною пухирчатки, поряд з ділянками нормальної експресії кадгерінов в міжклітинних просторах, виявлено їх зникнення з цієї локалізації або маскування при одночасній експресії кадгерінов-позитивного матеріалу в роговому шарі і / або на поверхні шкіри (малюнок б). Крім того, в 5 випадках додатково виявлено періцітоплазматіческая або перинуклеарной експресія в окремих клітинних елементах базального і шипуватий шарів з одночасною реакцією в зоні базальної мембрани епідермісу. Подібну іммуногістохімічскую картину спостерігали у випадках вегетирующей (1) і паранеопластіческой (1) пухирчатки. Якщо в разі вегетирующей пухирчатки відзначена тільки перинуклеарной експресія кадгерінов в окремих клітинних елементах, то в разі паранеопластіческой пухирчатки - додатково ділянками і в зоні базальної мембрани епідермісу. Крім того, в тому і в іншому випадках відмічено скупчення кадгерінов-позитивного матеріалу в роговому шарі і секвестрація його на поверхню шкіри.
Цікаво, що експресія кадгерінового комплексу при вульгарною пухирчатці відзначалася переважно (в 8 випадках з 11) в міжклітинних просторах базального і шипуватий шарів епідермісу. При цьому інтенсивність світіння при імуногістохімічної реакції була різною, від вираженої експресії кадгерінового комплексу до повного її відсутності в місцях початку формування внутріепідермальних міхура. У випадках освіти внутріепідермальних надбазального міхура виявлено парадоксальне явище: посилення експресії кадгерінов в Супрабазально шарах, що становлять покришку міхура.
У всіх 9 досліджених випадках себорейной пухирчатки в клінічно інтактних ділянках, а також в осередках ураження шкіри виявлена чітка картина порушення експресії кадгерінов: від різного ступеня експресії їх в міжклітинних просторах базального і шипуватий шарів до повного зникнення зі скупченням специфічного матеріалу в роговому шарі і секвестрацією його на поверхню шкіри. При цьому в місці формування внутріепідермальних міхура, як і в разі вульгарною пухирчатки, відзначена виражена експресія кадгерінов в Супрабазально шарах епідермісу, складових його покришку. Крім того, в 5 випадках з 9 додатково виявлено перинуклеарной експресія в окремих клітинних елементах, а в 3 інших випадках - в зоні базальної мембрани епідермісу.
У місцях формування внутріепідермальних бульбашок відзначено ураження міжклітинних з'єднань на більш протяжних ділянках епідермісу за участю всіх його верств і освітою як надбазальних (глибоких), так і поверхневих (на рівні зернистого шару) внутріепідермальних бульбашок. Цікаво, що у одного і того ж хворого можна спостерігати одночасно формування бульбашок на різних рівнях шарів епідермісу. При цьому посилення експресії кадгерінов виявлялося в цитоплазмі кератиноцитів верхніх шарів епідермісу, а в деяких випадках (3 випадки) одночасно і ділянками в зоні базальної мембрани епідермісу.
При одночасному дослідженні клінічно інтактних і уражених ділянок шкіри двох хворих себорейной пузирчаткой виявлена ідентична иммуноморфологических картина - ослаблення експресії кадгерінового комплексу на поверхні клітин базального і шипуватий шарів з періцітоплазматіческой або перинуклеарной експресією в окремих клітинних елелементах і секвестрацією специфічного матеріалу на поверхню шкіри. Причому в одному випадку виявлено експресія в зоні базальної мембрани епідермісу.
У разі листоподібною пухирчатки відмічено зникнення експресії молекул адгезії кадгерінов в широких зонах епідермісу, незважаючи на морфологічну патологію класичної локалізації поверхневого внутріепідермальних міхура з вираженою експресією в ньому кадгерінового комплексу.
При дослідженні кріостатних зрізів шкіри хворих бульозним пемфігоїд у всіх 16 досліджених випадках виявлено порушення експресії кадгерінового комплексу. Так, в більшості випадків (в 14 з 16) поряд з ділянками збереження кадгерінов на поверхні клітин епідермісу, виявлено зникнення або маскування молекул адгезії з проявом їх експресії в зоні базальної мембрани епідермісу і перинуклеарной зоні окремих клітинних елементів зі скупченням кадгерін- позитивного матеріалу під роговим шаром і секвестрацією на поверхню шкіри. Експресія кадгерінового комплексу в зоні базальної мембрани епідермісу відзначена в 10 випадках з 14, а в місці утворення подепідермального міхура також - на його покришці і дні. При цьому найбільш виражена експресія спостерігалася на покришці подепідермального міхура (малюнок в). У двох випадках буллезного пемфігоіда експресії кадгерінового комплексу не було зазначено ні в однієї зі структур епідермісу.
Експресія кадгерінового комплексу. Обробка моноклональними антитілами
до pan-cadherin. Непрямий метод імунофлюоресценції. х400:
a - кріостатних зріз практично здорової людини. Експресія кадгерінового комплексу в десмосоми міжклітинних просторів (стрілка) епідермісу; б - e: кріостатних зрізи клінічно інтактних ділянок шкіри хворих аутоімунними бульозні дерматози. Ділянки нормальної експресії кадгерінов перемежовуються з ділянками придушення (стрілка) їх експресії в десмосоми міжклітинних просторів при аутоімунної пузирчатке (b); в - бульозний пемфігоїд. Виражена експресія кадгерінов на покришці (стрілка) подепідермального міхура; г - лінійний IgA-залежний бульозні дерматози. Реакція в зоні базальної мембрани епідермісу (стрілка) з секвестрацією специфічного матеріалу
на поверхню шкіри; д - придбаний бульозний епідермоліз. виражена реакція
на дермальной частини (стрілка) подепідермального міхура
У двох досліджених випадках лінійного IgA-залежного буллезного дерматозу відзначено перинуклеарной експресія молекул адгезії в деяких кератиноцитах і в зоні базальної мембрани епідермісу з секвестрацією кадгерінов-позитивного матеріалу на поверхню шкіри (рисунок г). Подібну імуногістохімічну картину спостерігали і в 4 досліджених випадках придбаного буллезного епідермоліз. При цьому в місці розшарування дермо-епідермального з'єднання експресія молекул адгезії виявлена як на епідермальній, так і на дермальной частинах. Найбільш виражена імуногістохімічна реакція відзначена на дні подепідермального міхура (малюнок д).
Під впливом різних факторів, в тому числі аутоантитіл, відбувається дисоціація інтра- і екстрацелюлярний доменів кадгерінов. При цьому екстрацелюлярний домени кадгерінов відриваються від поверхні клітин в ході акантолиза, але цитоплазматический домен залишається на мембрані, зберігаючи зв'язок з цитоскелетом, скріплюється Катеніну. В ході імуногістохімічних досліджень цей цитоплазматический / внутрішньоклітинний домен кадгерінов є цілком достатнім для зв'язування антитіл, результатом чого виявляються позитивні реакції в нетиповою локалізації.
Таким чином, дане дослідження дозволило встановити не тільки залучення кадгерінового комплексу в иммунопатологический процес при аутоімунних бульозних дерматозах, а й виявити особливості його експресії при даних захворюваннях. Останнє можна використовувати в якості додаткового діагностичного маркера для диференціальної діагностики аутоімунних бульозних дерматозів, зокрема буллезного пемфігоіда і придбаного буллезного епідермоліз. Така діагностика аутоімунних бульозних дерматозів в ранні терміни захворювання дозволяє провести адекватну терапію зі зменшенням ризику продовження поглиблення патологічного процесу у хворих, які страждають аутоімунним бульозним дерматозом.
Сусково В.С. д.м.н. професор, зав. лабораторією иммунодиагностики і імунокорекції ФДМ «ФНЦТІО ім. академіка В.І. Шумакова »Мінздоровсоцрозвитку Росії, м.Москва;
Снарської Е.С. д.м.н. професор кафедри шкірних та венеричних хвороб факультету післявузівської професійної освіти лікарів ГОУ ВПО «Перший московський державний медичний університет ім. І.М. Сеченова »Мінздоровсоцрозвитку РФ, м.Москва.
Пропонуємо вашій увазі журнали, що видаються у видавництві «Академія природознавства»
(Високий імпакт-фактор РИНЦ, тематика журналів охоплює всі наукові напрямки)
Науковий журнал | ISSN 1812-7339 | ПІ №77-63397
Служба технічної підтримки - [email protected]
Відповідальний секретар журналу Бізенкова М.Н. - [email protected]
Матеріали журналу доступні на умовах ліцензії Creative Commons «Attribution» ( «Атрибуція») 4.0 Всесвітня.